Optique non linéaire sans marquage pour l’étude des défauts dépendants de la tubuline dans la myéline centrale
Summary
Dans cet article, nous présentons un protocole pour détecter les oligodendrocytes chargés de microtubules dans un modèle de tubulopathie grâce à une approche simple et innovante de microscopie de deuxième génération harmonique.
Abstract
La visualisation satisfaisante des composants du cytosquelette dans le cerveau est difficile. La distribution omniprésente des réseaux de microtubules, de microfilaments et de filaments intermédiaires dans tous les tissus neuraux, ainsi que la variabilité des résultats des stratégies de fusion de protéines fluorescentes et leur applicabilité limitée aux études dynamiques des anticorps et des médicaments en tant que véhicules chromophores, rendent les approches optiques classiques moins efficaces que pour d’autres protéines. Lorsque la tubuline doit être étudiée, la génération sans étiquette de secondes harmoniques est une option très appropriée en raison de l’organisation non centrosymétrique de la molécule. Cette technique, lorsqu’elle est conjuguée à la microscopie, peut décrire qualitativement la distribution volumétrique de faisceaux parallèles de microtubules dans des échantillons biologiques, avec l’avantage supplémentaire de travailler avec des tissus frais non fixés et non perméabilisés. Ce travail décrit comment imager la tubuline avec une installation commerciale de microscopie de deuxième génération d’harmoniques pour mettre en évidence les microtubules dans les structures enrichies en tubuline des oligodendrocytes, comme dans l’hypomyélinisation avec atrophie des noyaux gris centraux et la tubulinopathie du cervelet (H-ABC), un trouble de la myéline récemment décrit.
Introduction
L’imagerie optique des structures cytosquelettiques dans les tissus et les préparations d’organes n’est pas une tâche facile. Les filaments cytosquelettiques sont omniprésents, donc si une coloration générique est effectuée, par exemple, contre l’alpha-tubuline ou la bêta-actine ou potentiellement la kératine dans un échantillon épithélial, le signal sera probablement distribué de manière assez homogène dans tout l’échantillon. Pour limiter la coloration à un sous-ensemble plus significatif de composants cellulaires, on peut soit utiliser des souris transgéniques avec une expression ciblée1, soit envisager d’utiliser des anticorps spécifiques aux isoformes. Bien que très peu de ces derniers soient sur le marché (et très peu existent 2,3,4), un modèle animal transgénique pourrait être disponible. Cependant, il doit être acquis par le laboratoire et correctement logé, avec toutes les dépenses impliquées dans le processus. Certains anticorps ou produits chimiques, par exemple les médicaments conjugués au fluorophore comme la phalloïdine ou le paclitaxel, peuvent être partiellement ou totalement incompatibles avec l’utilisation dans des cellules ou des tissus vivants, limitant ainsi leur applicabilité aux seules études d’échantillons fixes.
Dans le cas de la tubuline, un aspect supplémentaire doit être pris en considération, à savoir la sensibilité du polymère à la fixation. La fixation chimique conventionnelle avec le formaldéhyde est connue pour ne pas être adéquate pour préserver de manière optimale l’intégrité des microtubules5. De plus, un rapport récent confirme que la réticulation du formaldéhyde induit des changements subtils dans l’ultrastructure du microtubule, similaires à ce qui se passe avec la liaison de certains médicaments ou molécules physiologiques tels que GTP6.
La visualisation directe des microtubules dans des échantillons non colorés et non fixés est donc souvent souhaitable. Pour y parvenir, une solution technique est la microscopie de deuxième génération harmonique (SHG) 7, qui repose sur la capacité de faisceauxde microtubules parallèles à agir comme des harmonophores et à émettre une lumière doublée en fréquence lorsqu’ils sont correctement éclairés avec un laser infrarouge intense et pulsé. Bien qu’un second signal harmonique plus fort et plus stable puisse être généré à partir du collagène et de la myosine, qui sont les deux seuls autres matériaux biologiques connus pour être capables de doubler la fréquence, le signal de la tubuline a été utilisé jusqu’à présent principalement pour étudier les réarrangements mitotiquesdu fuseau 8,9,10 et la morphologie des microtubules axonaux11,12,13.
Dans ce travail, nous introduisons une nouvelle utilisation de la microscopie SHG comme outil de diagnostic pour distinguer les tissus du système nerveux central (SNC) affectés par la tubuline bêta 4 A (TUBB4A) tubulopathie de leurs homologues sains14. Certaines des mutations survenant dans cette isoforme principalement neurale de la tubuline, comme celles provoquant l’hypomyélinisation et l’atrophie des noyaux gris centraux et du cervelet (H-ABC), induisent un surremplissage des microtubules dans les oligodendrocytes15,16; Les altérations du cytosquelette, à leur tour, sont associées à des effets en aval comme la dysmyélinisation, avec une altération profonde des voies motrices et sensorielles16,17,18,19. Le modèle murin de taiep utilisé dans ce travail présente une teneur anormale en microtubules dans les oligodendrocytes et récapitule la plupart des symptômes sensori-moteurs des patients H-ABC17. Le protocole explique comment imager des structures comme le corps calleux et le cervelet, qui sont généralement fortement myélinisés et qui sont gravement affectés chez les patients humains ainsi que chez le rat taiep 19, pour mettre en évidence les différences dans les signaux SH entre les tissus sains et mutants.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie SHG fait partie d’un groupe de techniques d’optique non linéaire, qui comprennent la microscopie à excitation à deux photons, la microscopie de troisième génération harmonique et la microscopie à diffusion Raman anti-Stokes cohérente, qui ont contribué à élargir la gamme d’applications de la microscopie optique conventionnelle aux sciences de la vie20.
Plus précisément, la force et la faiblesse majeures de la microscopie SHG sont liées…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) à travers les subventions suivantes: infraestructura 226450 à VP-CIO, infraestructura 255277 à V.P., et FORDECYT-PRONACES/194171/2020 à V.H. Nous remercions Juvenal Hernández Guevara de CIO pour son soutien dans la réalisation de vidéos.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
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