Нелинейная оптика без этикеток для изучения тубулин-зависимых дефектов в центральном миелине
Summary
В этой статье мы представляем протокол обнаружения олигодендроцитов, нагруженных микротрубочками, в модели тубулинопатии с помощью простого, инновационного подхода к микроскопии второй гармонической генерации.
Abstract
Удовлетворительная визуализация цитоскелетных компонентов в головном мозге является сложной задачей. Повсеместное распределение сетей микротрубочек, микрофиламентов и промежуточных нитей во всех нервных тканях вместе с изменчивостью результатов стратегий слияния флуоресцентных белков и их ограниченной применимостью к динамическим исследованиям антител и лекарств в качестве хромофорных носителей делают классические оптические подходы не такими эффективными, как для других белков. Когда тубулин необходимо изучить, генерация вторых гармоник без меток является очень подходящим вариантом из-за нецентросимметричной организации молекулы. Этот метод при сопряжении с микроскопией может качественно описать объемное распределение параллельных пучков микротрубочек в биологических образцах, с дополнительным преимуществом работы со свежими тканями, которые являются нефиксированными и неразрывноженными. В этой работе описывается, как изобразить тубулин с помощью коммерческой микроскопии второй гармонической генерации для выделения микротрубочек в обогащенных тубулином структурах олигодендроцитов, как при гипомиелинизации с атрофией базальных ганглиев и тубулинопатии мозжечка (H-ABC), недавно описанного расстройства миелина.
Introduction
Оптическая визуализация цитоскелетных структур в тканях и препаратах органов – непростая задача. Цитоскелетные нити распространены повсеместно, поэтому, если общее окрашивание выполняется, например, против альфа-тубулина или бета-актина или потенциально кератина в образце эпителия, сигнал, вероятно, будет распределен довольно однородно по всему образцу. Чтобы ограничить окрашивание более значимым подмножеством клеточных компонентов, можно либо использовать трансгенных мышей с целевой экспрессией1, либо планировать использование изоформ-специфических антител. В то время как очень немногие из последних представлены на рынке (и очень немногие из них существуют вообще 2,3,4), трансгенная модель животных может быть доступна. Тем не менее, он должен быть приобретен лабораторией и должным образом размещен, со всеми расходами, связанными с процессом. Некоторые антитела или химические вещества, например, флуорофор-конъюгированные препараты, такие как фаллоидин или паклитаксел, могут быть частично или полностью несовместимы с использованием в живых клетках или тканях, что ограничивает их применимость только к исследованиям фиксированных образцов.
В случае тубулина необходимо учитывать дополнительный аспект, которым является чувствительность полимера к фиксации. Традиционная химическая фиксация формальдегидом известна тем, что не является адекватной для оптимального сохранения целостности микротрубочек5. Кроме того, недавний отчет подтверждает, что сшивание формальдегида вызывает тонкие изменения в ультраструктуре микротрубочек, аналогичные тому, что происходит при связывании некоторых лекарств или физиологических молекул, таких как GTP6.
Поэтому прямая визуализация микротрубочек в незапятнанных, неповрежденных образцах часто желательна. Для достижения этого одним из технических решений является микроскопия второй гармонической генерации (SHG)7, которая основана на способности пучков параллельных микротрубочек действовать как гармониофоры и излучать удвоенный по частоте свет при правильном освещении интенсивным импульсным инфракрасным лазером. Хотя более сильный и стабильный второй гармонический сигнал может быть получен из коллагена и миозина, которые являются единственными двумя другими биологическими материалами, которые, как известно, способны к удвоению частоты, сигнал от тубулина до сих пор использовался в основном для изучения митотических перестроек веретена 8,9,10 и морфологии аксональных микротрубочек 11,12,13.
В этой работе мы представляем новое использование микроскопии SHG в качестве диагностического инструмента для различения тканей центральной нервной системы (ЦНС), пораженных тубулинопатией бета-4 А (TUBB4A), от их здоровых аналогов14. Некоторые из мутаций, происходящих в этой преимущественно нейронной изоформе тубулина, например, вызывающие гипомиелинизацию и атрофию базальных ганглиев и мозжечка (H-ABC), вызывают переполнение микротрубочек в олигодендроцитах15,16; цитоскелетные изменения, в свою очередь, связаны с последующими эффектами, такими как дисмиелинизация, с глубоким нарушением двигательных и сенсорных путей 16,17,18,19. Модель тайеповых мышей, используемая в этой работе, отображает аномальное содержание микротрубочек в олигодендроцитах и повторяет большинство сенсорно-моторных симптомов пациентов h-ABC17. Протокол объясняет, как визуализировать такие структуры, как мозолистое тело и мозжечок, которые обычно сильно миелинизированы и которые серьезно страдают у пациентов на людях, а также у крысы тайепа 19, чтобы подчеркнуть различия в сигналах SH между здоровыми и мутантными тканями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопия SHG является частью группы нелинейных оптических методов, которые включают в себя двухфотонную микроскопию возбуждения, микроскопию генерации третьей гармоники и когерентную рамановскую рассеянную микроскопию против Стокса, которые способствовали расширению спектра при…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным советом по вопросам науки и технологий (CONACYT) посредством следующих грантов: infraestructura 226450 для VP-CIO, infraestructura 255277 для V.P. и FORDECYT-PRONACES/194171/2020 для V.H. Мы признаем поддержку Хувенала Эрнандеса Гевары в CIO в создании видео.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
