بصريات غير خطية خالية من الملصقات لدراسة العيوب المعتمدة على التوبولين في المايلين المركزي
Summary
في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الخلايا قليلة التغصن المحملة بالأنابيب الدقيقة في نموذج لاعتلال الأنابيب من خلال نهج الفحص المجهري التوافقي الثاني البسيط والمبتكر.
Abstract
يمثل التصور المرضي للمكونات الهيكلية الخلوية في الدماغ تحديا. إن التوزيع في كل مكان لشبكات الأنابيب الدقيقة والشعيرات الدقيقة والخيوط الوسيطة في جميع الأنسجة العصبية ، جنبا إلى جنب مع التباين في نتائج استراتيجيات اندماج البروتين الفلوري وقابليتها المحدودة للتطبيق على الدراسات الديناميكية للأجسام المضادة والأدوية كمركبات كروموفور ، تجعل الأساليب البصرية الكلاسيكية ليست فعالة مثل البروتينات الأخرى. عندما يحتاج التوبولين إلى الدراسة ، فإن الجيل الخالي من الملصقات من التوافقيات الثانية يعد خيارا مناسبا جدا بسبب التنظيم غير المتماثل للجزيء. يمكن لهذه التقنية ، عند اقترانها بالفحص المجهري ، أن تصف نوعيا التوزيع الحجمي للحزم المتوازية من الأنابيب الدقيقة في العينات البيولوجية ، مع ميزة إضافية تتمثل في العمل مع الأنسجة الطازجة غير الثابتة وغير المنفذة. يصف هذا العمل كيفية تصوير التوبولين باستخدام إعداد مجهري تجاري من الجيل التوافقي الثاني لتسليط الضوء على الأنابيب الدقيقة في الهياكل المخصبة بالأنبوبين في الخلايا قليلة التغصن ، كما هو الحال في نقص الميالين مع ضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) اعتلال الأنابيب ، وهو اضطراب المايلين الموصوف مؤخرا.
Introduction
التصوير البصري للهياكل الهيكلية الخلوية في الأنسجة ومستحضرات الأعضاء ليست مهمة سهلة. خيوط الهيكل الخلوي موجودة في كل مكان ، لذلك إذا تم إجراء تلطيخ عام ، على سبيل المثال ، ضد ألفا توبولين أو بيتا أكتين أو يحتمل أن يكون الكيراتين في عينة ظهارية ، فمن المحتمل أن يتم توزيع الإشارة بشكل متجانس إلى حد ما في جميع أنحاء العينة. لتقييد التلوين إلى مجموعة فرعية أكثر وضوحا من المكونات الخلوية ، يمكن للمرء إما استخدام الفئران المعدلة وراثيا مع التعبير المستهدف1 أو التخطيط لاستخدام الأجسام المضادة الخاصة بالشكل المتساوي. في حين أن عددا قليلا جدا من هذه الأخيرة موجودة في السوق (ويوجد عدد قليل جدا منها على الإطلاق2،3،4) ، قد يتوفر نموذج حيواني معدل وراثيا. ومع ذلك ، يجب أن يحصل عليها المختبر وأن يتم إيواؤها بشكل صحيح ، مع جميع النفقات التي تنطوي عليها العملية. قد تكون بعض الأجسام المضادة أو المواد الكيميائية ، على سبيل المثال ، الأدوية المترافقة بالفلوروفور مثل phalloidin أو paclitaxel ، غير متوافقة جزئيا أو كليا مع الاستخدام في الخلايا أو الأنسجة الحية ، مما يحد من قابليتها للتطبيق على دراسات العينات الثابتة فقط.
في حالة التوبولين ، يجب أخذ جانب إضافي في الاعتبار ، وهو حساسية البوليمر للتثبيت. من المعروف أن التثبيت الكيميائي التقليدي بالفورمالديهايد غير كاف للحفاظ على سلامة الأنابيب الدقيقة على النحو الأمثل5. بالإضافة إلى ذلك ، يؤكد تقرير حديث أن تشابك الفورمالديهايد يؤدي إلى تغييرات طفيفة في البنية التحتية للأنابيب الدقيقة ، على غرار ما يحدث مع ربط بعض الأدوية أو الجزيئات الفسيولوجية مثل GTP6.
لذلك ، غالبا ما يكون التصور المباشر للأنابيب الدقيقة في العينات غير الملوثة وغير الثابتة أمرا مرغوبا فيه. لتحقيق ذلك ، فإن أحد الحلول التقنية هو الفحص المجهريللجيل التوافقي الثاني (SHG) 7 ، والذي يعتمد على قدرة حزم الأنابيب الدقيقة المتوازية على العمل كهارمونوفور وإصدار ضوء مضاعف التردد عند إضاءته بشكل صحيح باستخدام ليزر الأشعة تحت الحمراء النبضي المكثف. على الرغم من أنه يمكن توليد إشارة توافقية ثانية أقوى وأكثر استقرارا من الكولاجين والميوسين ، وهما المادتان البيولوجيتان الأخريان الوحيدتان المعروفتان بأنهما قادران على مضاعفة التردد ، فقد تم استخدام الإشارة من التوبولين حتى الآن في الغالب لدراسة إعادة ترتيب المغزل الانقسامي8،9،10 ومورفولوجيا الأنابيب الدقيقة المحورية11،12،13.
في هذا العمل ، نقدم استخداما جديدا لمجهر SHG كأداة تشخيصية لتمييز أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS) المتأثرة باعتلال الأنابيب tubulin beta 4 A (TUBB4A) عن نظيراتها الصحية14. بعض الطفرات التي تحدث في هذا الشكل العصبي في الغالب من التوبولين ، مثل تلك التي تسبب نقص الميالين وضمور العقد القاعدية والمخيخ (H-ABC) ، تحفز الأنابيب الدقيقة على ملء الخلايا قليلة التغصن15,16 ؛ ترتبط التغيرات الهيكلية الخلوية ، بدورها ، بتأثيرات المصب مثل خلل الميالين ، مع ضعف عميق في المسارات الحركية والحسية16،17،18،19. يعرض نموذج الفئران التايب المستخدم في هذا العمل محتوى الأنابيب الدقيقة غير الطبيعي في الخلايا قليلة التغصن ويلخص معظم الأعراض الحسية الحركية لمرضى H-ABC17. يشرح البروتوكول كيفية تصوير الهياكل مثل الجسم الثفني والمخيخ ، والتي عادة ما تكون شديدة الميالين والتي تتأثر بشدة في المرضى من البشر وكذلك في فأر تايب 19 ، لتسليط الضوء على الاختلافات في إشارات SH بين الأنسجة السليمة والمتحولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد الفحص المجهري SHG جزءا من مجموعة من تقنيات البصريات غير الخطية ، والتي تشمل الفحص المجهري للإثارة ثنائي الفوتون ، والمجهر من الجيل التوافقي الثالث ، والمجهر المتماسك المضاد لستوكس رامان ، والتي ساهمت في توسيع نطاق تطبيقات المجهر الضوئي التقليدي لعلوم الحياة20.
<p class="jove_con…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) من خلال المنح التالية: infraestructura 226450 إلى VP-CIO ، والبنية التحتية 255277 إلى V.P. ، و FORDECYT-PRONACES / 194171/2020 إلى V.H. نحن نعترف بدعم جوفينال هيرنانديز جيفارا في CIO في صناعة الفيديو.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
