Óptica no lineal sin etiquetas para el estudio de defectos dependientes de tubulina en mielina central
Summary
En este artículo, presentamos un protocolo para detectar oligodendrocitos cargados de microtúbulos en un modelo de tubulinopatía a través de un enfoque simple e innovador de microscopía de segunda generación armónica.
Abstract
La visualización satisfactoria de los componentes citoesqueléticos en el cerebro es un desafío. La distribución ubicua de las redes de microtúbulos, microfilamentos y filamentos intermedios en todos los tejidos neurales, junto con la variabilidad en los resultados de las estrategias de fusión de proteínas fluorescentes y su aplicabilidad limitada a estudios dinámicos de anticuerpos y fármacos como vehículos cromóforos, hacen que los enfoques ópticos clásicos no sean tan efectivos como para otras proteínas. Cuando la tubulina necesita ser estudiada, la generación sin etiqueta de segundos armónicos es una opción muy adecuada debido a la organización no centrosimétrica de la molécula. Esta técnica, cuando se conjuga con microscopía, puede describir cualitativamente la distribución volumétrica de haces paralelos de microtúbulos en muestras biológicas, con la ventaja adicional de trabajar con tejidos frescos que no están fijados ni permeabilizados. Este trabajo describe cómo obtener imágenes de la tubulina con una configuración comercial de microscopía de segunda generación armónica para resaltar los microtúbulos en las estructuras enriquecidas con tubulina de los oligodendrocitos, como en la hipomielinización con atrofia de los ganglios basales y la tubulinopatía del cerebelo (H-ABC), un trastorno de mielina descrito recientemente.
Introduction
La obtención de imágenes ópticas de estructuras citoesqueléticas en tejidos y preparaciones de órganos no es una tarea fácil. Los filamentos citoesqueléticos son ubicuos, por lo que si se realiza una tinción genérica, por ejemplo, contra alfa-tubulina o beta-actina o potencialmente queratina en una muestra epitelial, la señal probablemente se distribuirá de manera bastante homogénea en toda la muestra. Para restringir la tinción a un subconjunto más significativo de componentes celulares, se pueden usar ratones transgénicos con expresión dirigida1 o planear usar anticuerpos específicos de isoforma. Si bien muy pocos de estos últimos están en el mercado (y muy pocos existen en absoluto 2,3,4), un modelo animal transgénico podría estar disponible. Sin embargo, debe ser adquirido por el laboratorio y alojado adecuadamente, con todos los gastos involucrados en el proceso. Ciertos anticuerpos o productos químicos, por ejemplo, fármacos conjugados con fluoróforos como la faloidina o el paclitaxel, pueden ser parcial o totalmente incompatibles con el uso en células o tejidos vivos, lo que limita su aplicabilidad solo a estudios de muestras fijas.
En el caso de la tubulina, se debe tener en cuenta un aspecto adicional, que es la sensibilidad del polímero a la fijación. La fijación química convencional con formaldehído es conocida por no ser adecuada para preservar de manera óptima la integridad de los microtúbulos5. Además, un informe reciente confirma que la reticulación de formaldehído induce cambios sutiles en la ultraestructura del microtúbulo, similar a lo que sucede con la unión de algunos fármacos o moléculas fisiológicas como GTP6.
La visualización directa de microtúbulos en muestras no teñidas y no fijadas es, por lo tanto, a menudo deseable. Para lograr esto, una solución técnica es la microscopía7 de segunda generación armónica (SHG), que se basa en la capacidad de los haces de microtúbulos paralelos para actuar como armonóforos y emitir luz duplicada en frecuencia cuando se iluminan adecuadamente con un láser infrarrojo intenso y pulsado. Aunque se puede generar una segunda señal armónica más fuerte y estable a partir del colágeno y la miosina, que son los únicos otros dos materiales biológicos conocidos por ser capaces de duplicar la frecuencia, la señal de la tubulina se ha utilizado hasta ahora principalmente para estudiar los reordenamientos del huso mitótico 8,9,10 y la morfología de los microtúbulos axonales11,12,13.
En este trabajo, presentamos un uso novedoso de la microscopía SHG como herramienta de diagnóstico para distinguir los tejidos del sistema nervioso central (SNC) afectados por la tubulinopatía por tubulina beta 4 A (TUBB4A) de sus contrapartes sanas14. Algunas de las mutaciones que ocurren en esta isoforma predominantemente neural de tubulina, como las que causan hipomielinización y atrofia de los ganglios basales y cerebelo (H-ABC), inducen el sobrellenado de microtúbulos en los oligodendrocitos15,16; Las alteraciones citoesqueléticas, a su vez, están asociadas con efectos posteriores como la desmielinización, con un profundo deterioro de las vías motoras y sensoriales16,17,18,19. El modelo murino taiep utilizado en este trabajo muestra un contenido anormal de microtúbulos en los oligodendrocitos y recapitula la mayoría de los síntomas sensorio-motores de los pacientes con H-ABC17. El protocolo explica cómo visualizar estructuras como el cuerpo calloso y el cerebelo, que generalmente están altamente mielinizadas y que se ven gravemente afectadas en pacientes humanos, así como en la rata taiep 19, para resaltar las diferencias en las señales de SH entre tejidos sanos y mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopía SHG forma parte de un grupo de técnicas ópticas no lineales, que incluyen microscopía de excitación de dos fotones, microscopía de tercera generación armónica y microscopía de dispersión Raman anti-Stokes coherente, que han contribuido a ampliar la gama de aplicaciones de la microscopía óptica convencional a las ciencias de la vida20.
Específicamente, la mayor fortaleza y debilidad de la microscopía SHG se relaciona con la misma condición: …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a través de las siguientes subvenciones: infraestructura 226450 a VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P., y FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Reconocemos el apoyo de Juvenal Hernández Guevara en CIO en la realización del video.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
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