Ottica non lineare label-free per lo studio dei difetti tubulina-dipendenti nella mielina centrale
Summary
In questo articolo, presentiamo un protocollo per rilevare oligodendrociti caricati con microtubuli in un modello di tubulopatia attraverso un approccio di microscopia di seconda generazione armonica semplice e innovativo.
Abstract
La visualizzazione soddisfacente dei componenti citoscheletrici nel cervello è impegnativa. La distribuzione ubiquitaria delle reti di microtubuli, microfilamenti e filamenti intermedi in tutti i tessuti neurali, insieme alla variabilità negli esiti delle strategie di fusione delle proteine fluorescenti e alla loro limitata applicabilità agli studi dinamici di anticorpi e farmaci come veicoli cromofori, rendono gli approcci ottici classici non efficaci come per altre proteine. Quando la tubulina deve essere studiata, la generazione label-free di seconde armoniche è un’opzione molto adatta a causa dell’organizzazione non centrosimmetrica della molecola. Questa tecnica, quando coniugata alla microscopia, può descrivere qualitativamente la distribuzione volumetrica di fasci paralleli di microtubuli in campioni biologici, con l’ulteriore vantaggio di lavorare con tessuti freschi non fissati e non permeabilizzati. Questo lavoro descrive come visualizzare la tubulina con una configurazione commerciale di microscopia di seconda generazione armonica per evidenziare i microtubuli nelle strutture arricchite di tubulina degli oligodendrociti, come nell’ipomielinizzazione con atrofia dei gangli della base e della tubulopatia del cervelletto (H-ABC), un disturbo mielinico recentemente descritto.
Introduction
L’imaging ottico delle strutture citoscheletriche nei tessuti e nei preparati di organi non è un compito facile. I filamenti citoscheletrici sono onnipresenti, quindi se viene eseguita una colorazione generica, ad esempio, contro alfa-tubulina o beta-actina o potenzialmente cheratina in un campione epiteliale, il segnale sarà probabilmente distribuito in modo piuttosto omogeneo su tutto il campione. Per limitare la colorazione a un sottoinsieme più significativo di componenti cellulari, è possibile utilizzare topi transgenici con espressione mirata1 o pianificare l’uso di anticorpi isoforma-specifici. Mentre pochissimi di questi ultimi sono sul mercato (e pochissimi esistono affatto 2,3,4), potrebbe essere disponibile un modello animale transgenico. Tuttavia, deve essere acquisito dal laboratorio e adeguatamente alloggiato, con tutte le spese coinvolte nel processo. Alcuni anticorpi o sostanze chimiche, ad esempio i farmaci coniugati con fluorofori come la falloidina o il paclitaxel, possono essere parzialmente o totalmente incompatibili con l’uso in cellule o tessuti viventi, limitando così la loro applicabilità ai soli studi su campioni fissi.
Nel caso della tubulina, un ulteriore aspetto deve essere preso in considerazione, ovvero la sensibilità del polimero alla fissazione. La fissazione chimica convenzionale con la formaldeide è nota per non essere adeguata a preservare in modo ottimale l’integrità dei microtubuli5. Inoltre, un recente rapporto conferma che la reticolazione della formaldeide induce sottili cambiamenti nell’ultrastruttura del microtubulo, simile a quanto accade con il legame di alcuni farmaci o molecole fisiologiche come GTP6.
La visualizzazione diretta di microtubuli in campioni non colorati e non fissati è, quindi, spesso auspicabile. Per raggiungere questo obiettivo, una soluzione tecnica è la microscopia di seconda generazione armonica (SHG)7, che si basa sulla capacità di fasci di microtubuli paralleli di agire come monofori e di emettere luce raddoppiata in frequenza quando adeguatamente illuminati con un intenso laser a infrarossi pulsato. Sebbene un secondo segnale armonico più forte e più stabile possa essere generato dal collagene e dalla miosina, che sono gli unici altri due materiali biologici noti per essere in grado di raddoppiare la frequenza, il segnale della tubulina è stato finora utilizzato principalmente per studiare i riarrangiamenti del fuso mitotico 8,9,10 e la morfologia dei microtubuli assonali11,12,13.
In questo lavoro, introduciamo un nuovo uso della microscopia SHG come strumento diagnostico per distinguere i tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) affetti da tubulopatia beta 4 A (TUBB4A) dalle loro controparti sane14. Alcune delle mutazioni che si verificano in questa isoforma prevalentemente neurale della tubulina, come quelle che causano l’ipomielinizzazione e l’atrofia dei gangli della base e del cervelletto (H-ABC), inducono un riempimento eccessivo di microtubuli negli oligodendrociti15,16; Le alterazioni citoscheletriche, a loro volta, sono associate ad effetti a valle come la dismielinizzazione, con profonda compromissione delle vie motorie e sensoriali16,17,18,19. Il modello murino taiep utilizzato in questo lavoro mostra un contenuto anormale di microtubuli negli oligodendrociti e ricapitola la maggior parte dei sintomi senso-motori dei pazienti con H-ABC17. Il protocollo spiega come visualizzare strutture come il corpo calloso e il cervelletto, che di solito sono altamente mielinizzati e che sono gravemente colpiti nei pazienti umani e nel ratto taiep 19, per evidenziare le differenze nei segnali SH tra tessuti sani e mutanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopia SHG fa parte di un gruppo di tecniche di ottica non lineare, che includono la microscopia a eccitazione a due fotoni, la microscopia a generazione di terza armonica e la microscopia a diffusione Raman anti-Stokes coerente, che hanno contribuito ad ampliare la gamma di applicazioni della microscopia ottica convenzionale alle scienze della vita20.
In particolare, la maggiore forza e debolezza della microscopia SHG si riferiscono alla stessa condizione: il g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) attraverso le seguenti sovvenzioni: infraestructura 226450 a VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P. e FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Riconosciamo il supporto di Juvenal Hernández Guevara al CIO nella realizzazione del video.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
