中枢ミエリンにおけるチューブリン依存性欠陥の研究のためのラベルフリー非線形光学系

組織や臓器製剤中の細胞骨格構造の光学イメージングは簡単な作業ではありません。細胞骨格フィラメントはいたるところにあるため、例えば、上皮サンプル中のα-チューブリンまたはβ-アクチン、または潜在的にケラチンに対して一般的な染色が行われる場合、シグナルはサンプル全体にかなり均一に分布する可能性があります。染色を細胞成分のより意味のあるサブセットに制限するには、標的発現¹のトランスジェニックマウスを使用するか、アイソフォーム特異的抗体の使用を計画することができます。後者のほとんどが市場に出回っていませんが(そして、まったく存在しないものはほとんどありません^2,3,4)、トランスジェニック動物モデルが利用可能である可能性があります。ただし、ラボで取得し、適切に収容する必要があり、プロセスにすべての費用がかかります。特定の抗体または化学物質、例えばファロイジンやパクリタキセルなどの蛍光色素結合薬物は、生細胞または組織での使用と部分的または完全に適合しない可能性があるため、固定サンプルの研究のみに適用できます。

チューブリンの場合、追加の側面、すなわち固定に対するポリマーの感受性を考慮する必要があります。ホルムアルデヒドによる従来の化学的固定は、微小管の完全性を最適に保存するのに十分ではないことが知られています⁵。さらに、最近の報告では、ホルムアルデヒド架橋が、GTP⁶などの一部の薬物または生理学的分子の結合で起こるのと同様に、微小管の微細構造に微妙な変化を誘発することが確認されています。

したがって、染色されていない、固定されていないサンプル中の微小管を直接可視化することがしばしば望ましいです。これを達成するための技術的解決策の1つは、平行な微小管の束がハーモノフォアとして機能し、強力なパルス赤外線レーザーで適切に照らされたときに周波数倍の光を放出する能力に基づく第2高調波発生(SHG)顕微鏡7です。周波数倍増が可能なことが知られている他の2つの生物学的材料であるコラーゲンとミオシンから、より強力でより安定した第2高調波信号を生成できますが、チューブリンからの信号は、これまで主に有糸分裂紡錘体再配列^8,9,10および軸索微小管形態11,12,13の研究に使用されてきました。

この研究では、チューブリンベータ4A(TUBB4A)チューブリノパシーの影響を受けた中枢神経系(CNS)組織を健康な組織と区別するための診断ツールとしてのSHG顕微鏡の新しい使用法を紹介します¹⁴。この主に神経アイソフォームのチューブリンで発生する変異のいくつかは、大脳基底核および小脳(H-ABC)の髄鞘形成低下および萎縮を引き起こすものと同様に、希突起膠細胞の微小管の過剰充填を誘発します^15,16;次に、細胞骨格の変化は、髄鞘形成などの下流効果に関連しており、運動経路と感覚経路の深刻な障害を伴います^16,17,18,19。本研究で用いたマウスモデルは、希突起膠細胞の微小管含量の異常を示し、H-ABC患者の感覚運動症状のほとんどを再現している¹⁷。プロトコルは、健康な組織と変異組織の間のSH信号の違いを強調するために、通常は高度に有髄性であり、ヒト患者およびtaiepラット¹⁹で深刻な影響を受ける脳梁および小脳として構造を画像化する方法を説明します。