Óptica não linear livre de rótulos para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central
Summary
Neste artigo, apresentamos um protocolo para detectar oligodendrócitos carregados de microtúbulos em um modelo de tubulinopatia através de uma abordagem microscópica simples e inovadora de segunda geração harmônica.
Abstract
A visualização satisfatória dos componentes citoesqueléticos no cérebro é um desafio. A distribuição ubíqua das redes de microtúbulos, microfilamentos e filamentos intermediários em todos os tecidos neurais, juntamente com a variabilidade nos resultados das estratégias de fusão de proteínas fluorescentes e sua aplicabilidade limitada a estudos dinâmicos de anticorpos e drogas como veículos cromóforos, tornam as abordagens ópticas clássicas não tão eficazes quanto para outras proteínas. Quando a tubulina precisa ser estudada, a geração livre de rótulo de segundos harmônicos é uma opção muito adequada devido à organização não centrossimétrica da molécula. Esta técnica, quando conjugada à microscopia, pode descrever qualitativamente a distribuição volumétrica de feixes paralelos de microtúbulos em amostras biológicas, com a vantagem adicional de trabalhar com tecidos frescos não fixos e não permeabilizados. Este trabalho descreve como obter imagens de tubulina com uma configuração comercial de microscopia de segunda geração harmônica para destacar microtúbulos nas estruturas enriquecidas com tubulina dos oligodendrócitos, como na hipomielinização com atrofia dos gânglios da base e tubulinopatia do cerebelo (H-ABC), um distúrbio de mielina recentemente descrito.
Introduction
A imagem óptica de estruturas citoesqueléticas em tecidos e preparações de órgãos não é uma tarefa fácil. Os filamentos citoesqueléticos são onipresentes, portanto, se a coloração genérica for realizada, por exemplo, contra alfa-tubulina ou beta-actina ou potencialmente queratina em uma amostra epitelial, o sinal provavelmente será distribuído de forma bastante homogênea por toda a amostra. Para restringir a coloração a um subconjunto mais significativo de componentes celulares, pode-se usar camundongos transgênicos com expressão direcionada1 ou planejar o uso de anticorpos específicos de isoformas. Embora muito poucos destes últimos estejam no mercado (e muito poucos existam em todos os 2,3,4), um modelo animal transgênico pode estar disponível. No entanto, ele precisa ser adquirido pelo laboratório e devidamente alojado, com todos os gastos envolvidos no processo. Certos anticorpos ou produtos químicos, por exemplo, drogas conjugadas com fluoróforos, como faloidina ou paclitaxel, podem ser parcial ou totalmente incompatíveis com o uso em células ou tecidos vivos, limitando assim sua aplicabilidade apenas a estudos de amostras fixas.
No caso da tubulina, um aspecto adicional deve ser levado em consideração, que é a sensibilidade do polímero à fixação. A fixação química convencional com formaldeído é conhecida por não ser adequada para preservar de forma ideal a integridade dos microtúbulos5. Além disso, um relatório recente confirma que a reticulação de formaldeído induz mudanças sutis na ultraestrutura do microtúbulo, semelhante ao que acontece com a ligação de algumas drogas ou moléculas fisiológicas, como o GTP6.
A visualização direta de microtúbulos em amostras não coradas e não fixas é, portanto, muitas vezes desejável. Para conseguir isso, uma solução técnica é a microscopia de segunda geração harmônica (SHG)7, que se baseia na capacidade de feixes de microtúbulos paralelos de atuar como harmonóforos e emitir luz duplicada de frequência quando adequadamente iluminados com um laser infravermelho intenso e pulsado. Embora um segundo sinal harmônico mais forte e estável possa ser gerado a partir do colágeno e da miosina, que são os únicos outros dois materiais biológicos conhecidos por serem capazes de duplicação de frequência, o sinal da tubulina tem sido usado até o momento principalmente para estudar os rearranjos do fuso mitótico 8,9,10 e a morfologia dos microtúbulos axonais11,12,13.
Neste trabalho, apresentamos um novo uso da microscopia SHG como ferramenta diagnóstica para distinguir tecidos do sistema nervoso central (SNC) afetados pela tubulinopatia da tubulina beta 4 A (TUBB4A) de suas contrapartes saudáveis14. Algumas das mutações que ocorrem nessa isoforma predominantemente neural da tubulina, como as que causam hipomielinização e atrofia dos gânglios da base e do cerebelo (H-ABC), induzem o superenchimento de microtúbulos nos oligodendrócitos15,16; as alterações citoesqueléticas, por sua vez, estão associadas a efeitos a jusante, como a dismielinização, com profundo comprometimento das vias motora e sensorial16,17,18,19. O modelo murino de taiep utilizado neste trabalho apresenta conteúdo anormal de microtúbulos nos oligodendrócitos e recapitula a maioria dos sintomas sensório-motores de pacientes com H-ABC17. O protocolo explica como visualizar estruturas como o corpo caloso e o cerebelo, que geralmente são altamente mielinizadas e que são severamente afetadas em pacientes humanos, bem como no rato taiep 19, para destacar as diferenças nos sinais de HAS entre tecidos saudáveis e mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
A microscopia SHG faz parte de um grupo de técnicas de óptica não linear, que incluem microscopia de excitação de dois fótons, microscopia de terceira geração harmônica e microscopia coerente de espalhamento Raman anti-Stokes, que contribuíram para expandir a gama de aplicações da microscopia óptica convencional para as ciências da vida20.
Especificamente, a maior força e fraqueza da microscopia SHG referem-se à mesma condição: o gerador de sinal é n?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) através das seguintes subvenções: infraestructura 226450 ao VP-CIO, infraestructura 255277 a V.P. e FORDECYT-PRONACES/194171/2020 a V.H. Reconhecemos o apoio de Juvenal Hernández Guevara no CIO na produção de vídeos.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
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