אופטיקה לא ליניארית ללא תווית לחקר פגמים תלויי טובולין במיאלין המרכזי
Summary
במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי אוליגודנדרוציטים טעונים במיקרוטובולים במודל של טובולינופתיה באמצעות גישה פשוטה וחדשנית של מיקרוסקופיה הרמונית מהדור השני.
Abstract
ההדמיה המשביעת רצון של מרכיבים ציטוסקטליים במוח היא מאתגרת. ההתפלגות בכל מקום של רשתות של מיקרוטובולים, מיקרופילמנטים וחוטי ביניים בכל הרקמות העצביות, יחד עם השונות בתוצאות של אסטרטגיות היתוך חלבונים פלואורסצנטיים ויישומם המוגבל למחקרים דינמיים של נוגדנים ותרופות ככלי כרומופור, הופכים את הגישות האופטיות הקלאסיות ללא יעילות כמו עבור חלבונים אחרים. כאשר יש צורך לחקור טובולין, הדור ללא תווית של הרמוניות שניות הוא אופציה מתאימה מאוד בשל הארגון הלא צנטרוסימטרי של המולקולה. טכניקה זו, כאשר מצומדים למיקרוסקופיה, יכולה לתאר באופן איכותי את ההתפלגות הנפחית של צרורות מקבילים של מיקרוטובולים בדגימות ביולוגיות, עם היתרון הנוסף של עבודה עם רקמות טריות שאינן מסודרות ובלתי מנוצלות. עבודה זו מתארת כיצד לדמות טובולין עם מערך מיקרוסקופיה הרמוני מסחרי מהדור השני כדי להדגיש מיקרוטובולים במבנים המועשרים בטובולינים של האוליגודנדרוציטים, כמו בהיפומיאלינציה עם ניוון של הגרעינים הבסיסיים וטובולינופתיה של המוח הקטן (H-ABC), הפרעת מיאלין שתוארה לאחרונה.
Introduction
ההדמיה האופטית של מבנים ציטוסקטליים ברקמות ובהכנות איברים אינה משימה קלה. חוטים ציטוסקטליים נמצאים בכל מקום, כך שאם מבוצעת צביעה גנרית, למשל, נגד אלפא-טובולין או בטא-אקטין או אולי קרטין בדגימת אפיתל, סביר להניח שהאות יופץ בצורה הומוגנית למדי בכל רחבי הדגימה. כדי להגביל את הכתמים לתת-קבוצה משמעותית יותר של רכיבים תאיים, ניתן להשתמש בעכברים מהונדסים עם ביטוי ממוקד1 או לתכנן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורם. בעוד שמעט מאוד מהאחרונים נמצאים בשוק (ומעטים מאוד קיימים בכלל 2,3,4), מודל של בעלי חיים מהונדסים עשוי להיות זמין. עם זאת, הוא צריך להירכש על ידי המעבדה ולשכן אותו כראוי, עם כל ההוצאות הכרוכות בתהליך. נוגדנים או כימיקלים מסוימים, לדוגמה, תרופות מצומדות פלואורופור כמו פלואידין או פקליטקסל, עשויים להיות לא תואמים באופן חלקי או מלא לשימוש בתאים חיים או ברקמות, ובכך להגביל את תחולתם רק למחקרים של דגימות קבועות.
במקרה של טובולין, יש לקחת בחשבון היבט נוסף, שהוא הרגישות של הפולימר לקיבוע. קיבוע כימי קונבנציונלי עם פורמלדהיד ידוע בכך שאינו מספיק לשמירה אופטימלית על שלמות המיקרוטובולים5. בנוסף, דו”ח שפורסם לאחרונה מאשר כי הצלבת פורמלדהיד גורמת לשינויים עדינים במבנה האולטרה-מבנה של המיקרוטובול, בדומה למה שקורה עם קשירה של תרופות מסוימות או מולקולות פיזיולוגיות כגון GTP6.
ההדמיה הישירה של מיקרוטובולים בדגימות לא מוכתמות ולא מתוקנות היא, אם כן, רצויה לעתים קרובות. כדי להשיג זאת, פתרון טכני אחד הוא מיקרוסקופיה שנייה של הדור ההרמוני (SHG)7, המבוססת על היכולת של צרורות של מיקרוטובולים מקבילים לפעול כהרמונופורים ולפלוט אור כפול תדר כאשר הוא מואר כראוי בלייזר אינפרא אדום אינטנסיבי ופועם. למרות שניתן להפיק אות הרמוני שני חזק ויציב יותר מקולגן וממיוזין, שהם שני החומרים הביולוגיים האחרים היחידים הידועים כבעלי יכולת להכפיל תדרים, האות מטובולין שימש עד כה בעיקר לחקר סידור מחדש של צירים מיטוטיים 8,9,10 ומורפולוגיה של מיקרוטובולים אקסונאליים11,12,13.
בעבודה זו, אנו מציגים שימוש חדשני במיקרוסקופיית SHG ככלי אבחון להבחנה בין רקמות מערכת העצבים המרכזית (CNS) המושפעות מטובולין בטא 4 A (TUBB4A) טובולינופתיה לבין עמיתיהן הבריאים14. חלק מהמוטציות המתרחשות באיזופורם העצבי הזה של טובולין, כמו אלה הגורמות להיתמיאלינציה וניוון של הגרעינים הבסיסיים והמוח הקטן (H-ABC), גורמות למילוי יתר של מיקרוטובול באוליגודנדרוציטים15,16; השינויים הציטוסקטליים, בתורם, קשורים להשפעות במורד הזרם כמו דיסמיאלינציה, עם פגיעה עמוקה במסלולים המוטוריים והחושיים16,17,18,19. מודל הטייפ מורין המשמש בעבודה זו מציג תכולת מיקרוטובולים חריגה באוליגודנדרוציטים ומשחזר את רוב הסימפטומים החושיים-מוטוריים של חולי H-ABC17. הפרוטוקול מסביר כיצד לדמות מבנים כמו קורפוס קלוסום והמוח הקטן, שהם בדרך כלל מאוד מיאלינים ואשר מושפעים קשות בחולים אנושיים, כמו גם בחולדה taiep 19, כדי להדגיש את ההבדלים באותות SH בין רקמות בריאות ומוטנטיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופיית SHG היא חלק מקבוצה של טכניקות אופטיקה לא ליניאריות, הכוללות מיקרוסקופיית עירור של שני פוטונים, מיקרוסקופיה של הדור ההרמוני השלישי ומיקרוסקופיית פיזור קוהרנטית נגד סטוקס ראמאן, שתרמו להרחבת מגוון היישומים של מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית למדעי החיים20.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) באמצעות המענקים הבאים: infraestructura 226450 ל- VP-CIO, infraestructura 255277 ל- V.P., ו- FORDECYT-PRONACES/194171/2020 ל- V.H. אנו מכירים בתמיכתו של יובנאל הרננדס גווארה במנמ”ר בהפקת הסרטונים.
Materials
| 405/10 nm BrightLine(R) single-band bandpass filter | Semrock | FF01-405/10-25 | 32 mm diameter, with housing ring |
| Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric | Thorlabs | BK5 | 5' x 9' (1.5 m x 2.7 m) x 0.005" (0.12 mm) Thick |
| Blades for vibratome | any commercial; e.g. Wilkinson Sword | Classic stainless steel double edge razor blades | |
| Cell culture dishes, 35 mm | any commercial; e.g. Falcon | 351008 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM710NLO AxioObserver Z1 | Inverted microscope, objective used is LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA |
| Cooler | any commercial | Any insulated, polystyrene box could work, to mantain the sample at about 37 °C | |
| Corn stach | e.g. Maizena | From the supermarket | |
| Coverslips #1.5 | any commercial | Rectangular | |
| Cyanoacrylate glue | e.g. Loctite | To glue the brain to the masking tape | |
| Fine forceps | fine science tools | 11412-11 | To manipulate tissue sections by handling from the meninges |
| Fine scissors | fine science tools | 14370-22 | To cut the skin |
| Fine scissors curved tip | fine science tools | 14061-09 | To cut along the midline |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | 252549 | To dilute 1:10 in PBS |
| Friedman Rongeur | fine science tools | 16000-14 | To cut the bone |
| Gel packs | any commercial | Prewarmed to 37 °C, to help mantaining the temperature inside the cooler | |
| Glass Pasteur pipette, modified | any commercial | To transfer the tissue section | |
| Hanks′ Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | Could be prepared from powders |
| Kelly hemostats | fine science tools | 13018-14 | To separate the bone |
| Masking tape | any commercial | To protect th surface of the specimen plate | |
| NDD module, type C | Zeiss | 000000-1410-101 | To detect the signal, reducing light loss. Housing the 000000-1935-163 filter set with the SP485 |
| Offset bone nippers | fine science tools | 16101-10 | To cut the bone |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-031 | Could be prepared from powders or tabs |
| Pulsed laser | Coherent | Chameleon Vision II | 680–1080 nm tunable laser |
| Scalpel | any commercial | Straight blade with sharp point | |
| Standard pattern forceps | fine science tools | 11000-18 | |
| Vannas spring scissors | fine science tools | 15018-10 | To cut meninges that remain joined to both the slice obtained from vibratome cutting and the section glued to the specimen plate. |
| Vibratome | any commercial; e.g. Leica | VT1200 |
References
- Palmiter, R. D., et al. Cell lineage ablation in transgenic mice by cell-specific expression of a toxin gene. Cell. 50 (3), 435-443 (1987).
- Banerjee, A., et al. A monoclonal antibody against the type II isotype of beta-tubulin. Preparation of isotypically altered tubulin. The Journal of Biological Chemistry. 263 (6), 3029-3034 (1988).
- Banerjee, A., Roach, M. C., Trcka, P., Luduena, R. F. Preparation of a monoclonal antibody specific for the class IV isotype of beta-tubulin. Purification and assembly of alpha beta II, alpha beta III, and alpha beta IV tubulin dimers from bovine brain. The Journal of Biological Chemistry. 267 (8), 5625-5630 (1992).
- Banerjee, A., et al. Localization of βv tubulin in the cochlea and cultured cells with a novel monoclonal antibody. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 505-514 (2008).
- Cross, A. R., Williams, R. C. Kinky microtubules: Bending and breaking induced by fixation in vitro with glutaraldehyde and formaldehyde. Cell Motility and the Cytoskeleton. 20 (4), 272-278 (1991).
- Van Steenbergen, V., et al. Molecular understanding of label-free second harmonic imaging of microtubules. Nature Communications. 10 (1), 3530 (2019).
- Campagnola, P. J., Clark, H. A., Mohler, W. A., Lewis, A., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy of living cells. Journal of Biomedical Optics. 6 (3), 277 (2001).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophysical Journal. 82 (1), 493-508 (2002).
- Yu, C. -. H., et al. Measuring microtubule polarity in spindles with second-harmonic generation. Biophysical Journal. 106 (8), 1578-1587 (2014).
- Bancelin, S., et al. Probing microtubules polarity in mitotic spindles in situ using Interferometric Second Harmonic Generation Microscopy. Scientific Reports. 7, 6758 (2017).
- Dombeck, D. A., et al. Uniform polarity microtubule assemblies imaged in native brain tissue by second-harmonic generation microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7081-7086 (2003).
- Psilodimitrakopoulos, S., et al. Estimation of the effective orientation of the SHG source in primary cortical neurons. Optics Express. 17 (16), 14418 (2009).
- Sharoukhov, D., Bucinca-Cupallari, F., Lim, H. Microtubule imaging reveals cytoskeletal deficit predisposing the retinal ganglion cell axons to atrophy in DBA/2J. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (13), 5292 (2018).
- Alata, M., Piazza, V., Eguibar, J. R., Cortes, C., Hernandez, V. H. H-ABC tubulinopathy revealed by label-free second harmonic generation microscopy. Scientific Reports. 12, 14417 (2022).
- Duncan, I. D., Lunn, K. F., Holmgren, B., Urba-Holmgren, R., Brignolo-Holmes, L. The taiep rat: A myelin mutant with an associated oligodendrocyte microtubular defect. Journal of Neurocytology. 21 (12), 870-884 (1992).
- Duncan, I. D., et al. A mutation in the Tubb4a gene leads to microtubule accumulation with hypomyelination and demyelination: Tubb4a Mutation. Annals of Neurology. 81 (5), 690-702 (2017).
- Garduno-Robles, A., et al. MRI features in a rat model of H-ABC tubulinopathy. Frontiers in Neuroscience. 14, 555 (2020).
- Lopez-Juarez, A., et al. Auditory impairment in H-ABC tubulinopathy. Journal of Comparative Neurology. 529 (5), 957-968 (2021).
- Alata, M., et al. Longitudinal evaluation of cerebellar signs of H-ABC tubulinopathy in a patient and in the taiep model. Frontiers in Neurology. 12, 702039 (2021).
- Parodi, V., et al. Nonlinear optical microscopy: From fundamentals to applications in live bioimaging. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 585363 (2020).
- Lefort, C. A review of biomedical multiphoton microscopy and its laser sources. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (42), 423001 (2017).
- Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nature Biotechnology. 21 (11), 1356-1360 (2003).
- vander Knaap, M. S., et al. New syndrome characterized by hypomyelination with atrophy of the basal ganglia and cerebellum. American Journal of Neuroradiology. 23 (9), 1466 (2002).
- Stoller, P., Kim, B. -. M., Rubenchik, A. M., Reiser, K. M., Da Silva, L. B. Polarization-dependent optical second-harmonic imaging of a rat-tail tendon. Journal of Biomedical Optics. 7 (2), 205 (2002).
- Brown, E. B., et al. In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nature Medicine. 7 (7), 864-868 (2001).
- Chakraborti, S., Natarajan, K., Curiel, J., Janke, C., Liu, J. The emerging role of the tubulin code: From the tubulin molecule to neuronal function and disease. Cytoskeleton. 73 (10), 521-550 (2016).
