JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
português

Automatically Generated
Cancer Research

Expansão e enriquecimento de células T Gama-Delta (γδ) do produto humano aferido

Published: September 22, 2021
doi:
10.3791/62622
, , , , ,
1Cell Therapy Facility,Moffitt Cancer Center and Research Institute, 2Department of Immunology,Moffitt Cancer Center and Research Institute

Summary

Apresentado é um protocolo para a expansão do produto de células T Gama-Delta (γδ). Os linfócitos são isolados por elutriação e enriquecidos com ácido zoledrônico e interleucina-2. As células T alfa-beta estão esgotadas usando um dispositivo de separação magnética de grau clínico. As células γδ são co-cultivadas com células derivadas de antígenos artificiais e expandidas.

Abstract

Embora as células T Vγ9Vδ2 sejam um pequeno subconjunto de linfócitos T, essa população é procurada por sua capacidade de reconhecer antígenos de uma forma importante e de histocompatibilidade (MHC) independente e desenvolver uma forte função de efeito citóltico que o torna um candidato ideal para a imunoterapia contra o câncer. Devido à baixa frequência das células T Gama-Delta (γδ) no sangue periférico, desenvolvemos um protocolo eficaz para expandir um produto de células γδ t altamente puro para o uso in primeiro em humano de células γδ alusicais em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA). Usando aferese saudável do doador como fonte celular alergênica, os linfócitos são isolados usando um dispositivo validado para um método de centrifugação de contrafluxo de separar células por tamanho e densidade.

A fração rica em linfócitos é utilizada, e as células γδ T são preferencialmente ativadas com ácido zoledrônico (aprovado pela FDA) e interleucina (IL)-2 por 7 dias. Após a expansão preferencial das células T γδ, um dispositivo de separação celular magnética de grau clínico e contas TCRαβ são usadas para esgotar as células T contaminantes (TCR)αβ T. As células γδ T altamente enriquecidas passam então por uma segunda expansão usando células artificiais de presente de antígeno (aAPCs) projetadas de células K562 geneticamente modificadas para expressar fragmento variável de cadeia única (scFv) para CD3 e CD28, 41BBL (CD137L) e IL15-RA-juntamente com ácido zoledr e IL-2. A semeadura de todas as células γδ T enriquecidas no dia 7 em co-cultura com os aAPCs facilita a fabricação de células γδ T altamente puras com uma expansão média de dobra de >229.000 vezes de sangue saudável do doador.

Introduction

A recaída da leucemia é a principal causa de mortalidade após o transplante hematopoiético de células (HCT) em pacientes com LMA1,2,3. Uma melhor sobrevida livre de leucemia foi relatada com o aumento da recuperação das células γδ T sanguíneas após o HCT sem o aumento do risco de Doença do Enxerto versus Hospedeiro (GVHD)4. A capacidade das células γδ T de reconhecer antígenos de forma independente do MHC e desenvolver fortes funções de efeitos citolíticos e th1 tornam esta pequena subpopulação de células T ideal para o tratamento de pacientes com LMA submetidos a transplante alogênico em risco de recaída5. Dado que as células T Vγ9Vδ2 são um pequeno subconjunto de linfócitos T que variam de 0,5% a 5% das células T na periferia6, propusemos estabelecer um sistema robusto para expandir essa rara população de células sanguíneas para alcançar doses potencialmente terapêuticas para ensaios clínicos.

Embora outros tenham expandido com sucesso células γδ T usando ácido zoledrônico e até mesmo aAPCs, desenvolvemos um processo que pode potencialmente expandir as células γδ T em 229.749 vezes. A expansão é fofásica: primeiro, os linfócitos são obtidos por elutriação utilizando o instrumento de separação. O equipamento fornece um sistema fechado que permite a separação de células com base em seu tamanho, forma e densidade por centrifugação de contrafluxo. Após enriquecer para linfócitos, a expansão seletiva das células T Vγ9Vδ2 é alcançada pelo tratamento com ácido zoledrônico e IL-2 por 7 dias. Imediatamente após este tratamento, as células TCR-αβ T são esgotadas usando a tecnologia de microesferas, permitindo a posterior expansão das células T γδ com aAPCs derivados de K562.

Para validação do processo, apenas 5 × 106 células γδ T expandidas por ácido zoledrônico foram utilizadas para a expansão da cocultura fase 2 com aAPCs. Nesta segunda fase de expansão, as células γδ T são ativadas usando um banco de células de trabalho (WCB) compatível com boas práticas de fabricação (WCB) de aAPCs derivados geneticamente (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fabricados na Moffitt. A lógica dessa expansão fáfasica baseia-se na capacidade do ácido zoledrônico de inibir a distease de difosfato farnésico (FDPS) em monócitos, levando ao acúmulo de pirofosfato isopaténico, que estimula diretamente as células Vγ2Vδ2. Na segunda fase de expansão, os aAPCs derivados do K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fornecem uma estimulação robusta para todas as células T. No entanto, o produto celular já foi enriquecido para as células γδ T, resultando em uma expansão robusta das células γδ T.

Com o uso de equipamentos e frascos específicos, o processo é um sistema funcionalmente fechado, diminuindo assim o risco de contaminação. Além disso, o bioreator de sistema fechado 1 L facilita o crescimento máximo e a expansão das células em um volume total de 1 L de médio com mínima necessidade de alimentação. A vantagem do método Moffitt é que ele fornece um sistema GMP rápido, reprodutível e altamente viável para produzir um produto celular γδ T altamente puro e derivado de doadores para administração aogenética. Este método pode ser aplicado a qualquer ensaio clínico que visa o uso de células γδ T humanas expressando receptores de células T Vγ2Vδ2 como imunoterapia adotiva para mediar a imunidade contra micróbios e tumores em pacientes com câncer com remissão parcial e completa. Além disso, fornece uma plataforma robusta para o desenvolvimento e produção de células T γδ quimérico receptor-positivo (CAR+).

Protocol

NOTA: A aprovação do IRB foi obtida e o consentimento informado foi obtido dos doadores. 1. Isolamento do linfócito Transfira o produto da aferese para uma sala limpa.NOTA: A validação do processo foi realizada utilizando-se aferese normal do doador de um fornecedor comercial externo compatível com as normas de coleta de matérias-primas. Coletar amostras para testes de esterilidade, contagem de células e fenotipagem celular. Elutriate no dispositivo de centrifugação de contrafluxo usando um meio primário da Solução de Sal Balanceado Hanks com 1% de albumina de soro humano (HSA) e um meio secundário de solução salina (0,9% injeção de cloreto de sódio USP) ou salina fosfato-tampão de dulbecco (DPBS). Defina a velocidade de centrifugação da elutriação em 900 × g e colete frações com base na taxa de fluxo e no tempo. Coletar amostras da fração 2 e realizar os seguintes testes: 2 mL para testes de esterilidade; 0,5 mL para contagem de células e viabilidade utilizando iodeto de acridina laranja/propidium (AO/PI); 5 × 106 células para fenotipagem celular por citometria de fluxo. Expanda uma fração de linfócito puro (fração 2) de células na cultura a 10 × 106 células/cm2 em um bioreator de sistema fechado de 1 L com 5 μmol/L de ácido zoledrônico e 300 UI/mL de IL-2. Incubar por sete dias em uma incubadora fixada a 37 °C com 5% de CO2. 2. Esgotamento de células T Alfa-beta (αβ) Células de colheita do frasco bioreator do sistema fechado 1 L. Soldar estéril um pacote de transferência de 1 L para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado, e usar a bomba farmacêutica apropriada para transferir as células para o pacote de transferência. Pegue as seguintes amostras: 10 mL para esterilidade média gasta; 0,5 mL de células para contagem de células e viabilidade utilizando AO/PI; 5 × 106 células para citometria de fluxo Resuspend as células em ~5 × 108 células/mL em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) ou (PBS/ethylenodiaminetetraactic acid (EDTA)) tampão + 0,5% HSA e anticorpos tcr αβ-específicos biotinilados. Coloque o agitador na geladeira e incuba as células a 2-8 °C por aproximadamente 15 minutos com agitação. Lave as células com um total de 600 mL de tampão PBS/EDTA + 0,5% HSA. Centrífuga para remover o anticorpo desvinculado em 200-500 × g por 15 min a 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 células/mL em buffer PBS/EDTA + 0,5% HSA com microesferas anti-biotina (7,5 mL/1 frasco). Coloque o agitador na geladeira e incuba as células a 2-8 °C por aproximadamente 15 minutos com agitação. Após a incubação, centrifugar as células a 200-500 × g por 15 min a 2-8 °C para remover as microesferas não ligadas. Resuspend ~6 × 107 células/mL no buffer PBS/EDTA + 0,5% HSA e transfira-as para uma mala de transferência. Instale o conjunto de tubos no dispositivo de separação celular magnética de grau clínico seguindo as instruções do fabricante, coloque as embalagens com o tampão PBS/EDTA e o pacote de transferência com o produto celular no instrumento e bata-o quando instruído pelo instrumento. Selecione o protocolo Depletion 1.2 para o esgotamento das células αβ T rotuladas. Centrifugar a fração alvo (células γδ t enriquecidas) e resuspensar as células em meio suplementado com soro AB 10% humano. Pegue uma amostra de 0,5 mL e realize uma contagem de células e viabilidade com a mancha AO/PI. Leve as células a uma concentração final de aproximadamente 1 × 106 células/mL. Pegue uma amostra de 5 × 106 células do produto para fenotometria de fluxo pós-esgotamento. 3. Co-cultura com aAPCs Irradiar 5 × 107 aAPCs/frasco a 100 Gy no instrumento gerador de raios-X. Use os aAPCs na cocultura em uma proporção de 10:1 com as células γδ T. Coloque as células aAPCs irradiadas (5 × 107 células/frascos) e γδ T (5 × 106 células/frascos) em frascos bioreatores de sistema fechado 1 L com 1 L de meio de cultura suplementado com soro AB 10% humano. Semente até 10 frascos. Expanda as células na cultura por 10 dias em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Monitore os níveis de glicose e lactato a cada 3-4 dias usando tiras, glicose e um medidor de lactato. Se a glicose cair para 250 mg/dL, reduza o volume no frasco para 200 mL usando uma bomba farmacêutica por solda estéril um pacote de transferência de 1 L para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado. Misture as células nos 200 mL restantes e pegue uma amostra de 0,5 mL para contagem celular e medição de viabilidade por coloração AO-PI. Se a contagem de células for ≥109, divida um frasco em dois frascos e encha cada frasco até 1 L com AIM-V complementado com soro AB 10% humano. Se a contagem de células for <109, alimente as células com um litro fresco de cultura de meio suplementado com soro AB 10% humano. Repita o passo 3.6 para todos os frascos e devolva-os à incubadora a 37 °C e 5% de CO2. Repita as etapas 3.4-3.7 a cada 3 a 4 dias. 4. Colheita celular Ao final de 10 dias em co-cultura, colhe todos os frascos bioreatores. Colher 1 frasco de bioreator de cada vez, e juntar todas as células em um pacote de transferência de tamanho apropriado. Soldar o pacote de transferência para a linha vermelha do bioreator do sistema fechado, e usar a bomba farmacêutica para transferir as células para o pacote de transferência. Remova as seguintes amostras de controle de qualidade: 1% do produto medicamentoso (DP) para esterilidade por cultura sanguínea e coloração gramada; 0,5 mL para contagem de células e viabilidade utilizando AO/PI; 5-10 × 106 células para citometria de fluxo (ver Figura 1 para estratégia de gating); 0,5 mL para endotoxina; 0,5 mL para coloração de grama; 106 células cravadas em 10 mL de meio gasto para testes de Mycoplasma. Centrifugar as células a 200-500 × g por 15 minutos à temperatura ambiente e descartar o sobrenante. Lave as células em uma solução de solução cristalina balanceada+ 0,5% HSA a 200-500 × g por 15 min a temperatura ambiente. Resuspennciá-los em um volume-alvo de 100-300 mL de solução cristalina equilibrada + 0,5% HSA. 5. Teste de liberação Realizar testes de controle de qualidade da célula γδ T DP para os seguintes: pureza e identidade por citometria de fluxo (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); viabilidade por manchas ao/PI; endotoxina; Teste de mycoplasma por reação em cadeia de polimerase (PCR); esterilidade por manchas gramas e culturas sanguíneas aeróbicas e anaeróbicas; ensaio residual K562 por citometria de fluxo (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

O processo celular γδ T foi caracterizado e otimizado para a produção do produto de célula γδ T. Otimização de processos incluída 1) enriquecimento de linfócitos utilizando elutriação, 2) expansão específica da substância celular γδ T (DS) com ácido zoledrônico, 3) γδ T célula DS esgotamento de TCRαβ, 4) expansão secundária da célula γδ T DS usando aAPCs derivadas de K562, e 5) colheita final de DP e formulação de produto para administração ou criopreservação. Após a otimização do processo, as corridas de confirmação foram realizadas em escala utilizando o material derivado de três doadores saudáveis para confirmar a adequação do processamento celular. Todos os dados foram analisados e estão resumidos na Tabela 1, Tabela 2 e Tabela 3. As células separadas da fração de centrifugação pós-contrafluxo 2 (F2) produziram uma população pura de linfócitos com uma média de 99,23% de células CD45+ (relatada como a frequência do portão vivo total) e excelente viabilidade média de 95,80% (Tabela 1). A expansão específica das células T γδ com ácido zoledrônico dependia da porcentagem inicial de células assassinas naturais (NK) presentes na fração de linfócito (F2) após a elutriação. O enriquecimento da célula γδ T DS com esgotamento TCRαβ foi consistente (Tabela 2). A célula γδ T DP fabricada a partir de três doadores saudáveis teve uma média de 0,11% ± 0,05% células B CD20+ e 0,00% ± células TCR αβ+ T de 0,00%, atendendo assim ao critério de liberação de ≤1% das células T. O percentual médio de células NK no produto final é de 17,06% ± 26,19% e atende ao critério de liberação de <35%. Além disso, o percentual médio de células T e células NK linhagem-negativa no produto final foi de 0,48% ± 0,42% (Tabela 3). A coloração da superfície celular e a análise citométrica de fluxo foram utilizadas para caracterizar a identidade, pureza e impurezas de processo do DS e DP, conforme mostrado na Figura 2A-D. A expansão secundária, obtida a partir da cocultura do aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB e γδ T cell DS em uma proporção de 10:1, gerou um DP de célula γδ T que atendeu a todos os critérios de liberação, como mostrado na Tabela 4. Além disso, as células foram manchadas e avaliadas por citometria de fluxo nas células F2 do dia 0- contrafluxo, Dia 7-zoledrônico células T expandidas por ácido, Dia 7-TCR αβ T esgotamento celular, Dp dia 17-final para o seguinte conjunto biomarcadores de diferenciação (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, receptor de quimioterapia CC 7 (CCR7), proteína de morte celular programada-1 (PD-1), proteína associada ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA4), gene ativador de linfócitos 3 (LAG3) e imunoglobulina t celular e proteína contendo domínio de mucina 3 (TIM3). Os dados apresentados na Figura 3 são mediados a partir de três corridas independentes e demonstram que as células não atingiram a exaustão. O CTF Moffitt também desenvolveu um ensaio residual K562 para determinar as impurezas de DP relacionadas aos AAPCs derivados do K562 (Figura 4). A estratégia de gating citométrica de fluxo utilizada para caracterizar os percentuais dos tipos celulares foi a seguinte: 1) gating na população t e nk linhagem-negativa (CD3-CD56-CD16-); 2) portão em CD71+ (receptor transferrina expresso em linhagem eritróide e LMA permitindo a detecção de células residuais K562). Essa estratégia de gating permitiu a avaliação das células CD3-CD16-CD56-CD71+, que são o aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (denominado “residual K562” na Figura 4). Esta gating permite a enumeração do residual K562 no DP final multiplicando a frequência de resíduos K562 pela contagem total viável (TVC) da DP (71+ × DP TVC = Células Residuais K562 no DP). Todos os dados citométricos de fluxo são relatados como a frequência das células vivas. A Tabela 5 e a Figura 4 fornecem os percentuais de células T e linhagem celular NK negativo, bem como células residuais K562. Realizou-se um teste t de duas caudas para determinar a significância estatística das diferenças entre essas populações e revelou que houve uma diferença significativa entre a célula WCB e a célula γδ T DP e entre as células WCB e γδ T (t = 0,0019 para células T e linhagem de células NK-negativos; t < 0,0001 para K562 residual e t = 0,0314 para célulaS T e linhagem celular NK negativo; t < 0,0001para Residual K562) (Tabela 5). Figura 1: Representação esquemática da estratégia de gating de fluxo. Abreviaturas: aAPC = , célula que apresenta antígeno artificial; SSC-A = área de dispersão lateral do pico; FSC-A = área de dispersão para a frente do pico; SSC-H = altura de dispersão lateral do pico; FSC-H = altura de dispersão para a frente do pico; CD = cluster de diferenciação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Composição de Material Inicial, Intermediários e Produto De Drogas Finais. Todos os dados mostrados são médios de três corridas independentes. (A) A aferese de doadores saudáveis sofre elutriação usando o dispositivo de centrifugação de contrafluxo, resultando em F2 (fração rica em linfócitos), que é usado como material inicial. (B) O F2 sofre expansão vγ9Vδ2 T específica das células por 7 dias com 5 μmol/L de ácido zoledrônico e 300 UI/mL de IL-2 em 1 L de médio suplementado com soro AB 10% humano. (C) O esgotamento da célula TCR αβ T é realizado no produto expandido por ácido zoledrônico. (D) Um produto de droga de célula γδ t altamente puro é colhido após uma segunda expansão de 10 dias com aAPCs irradiados a uma razão de 1:10 com 5 μmol/L de ácido zoledrônico e 300 UI/mL de IL-2 em 1 L de médio suplementado com 10% de soro AB humano. Abreviaturas: NK = assassino natural; CD = cluster de diferenciação; TCR= receptor de células T; IL = interleucina; aAPCs = células que apresentam antígenos artificiais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Biomarcadores de Material Inicial, Intermediários e Produto De Drogas Finais. As células são coletadas e manchadas para CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 e TIM3 no dia 0-Contrafluxo Centrifugação Células F2, Dia 7-zoledronic células T expandidas por ácido, Dia 7-TCR αβ T esgotamento celular, Dia 17-Final Produto de Drogas. Todos os dados mostrados são médios de três corridas independentes. (A) Semelhante a haste (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO-e CCR7+) mostrados como um número total de células vivas. (B) Memória central (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+e CCR7+) retratada como uma porcentagem das células CD3+ TCR γδ+. Abreviaturas: CD = cluster de diferenciação; TCR= receptor de células T; IL = interleucina; . CCR7 = receptor de quimioterapia CC 7; PD-1 = proteína de morte celular programada-1; CTLA4 = proteína citotóxica associada ao linfócito T 4; LAG3 = gene ativador de linfócitos 3; TIM3 = Imunoglobulina t celular e proteína contendo domínio de mucina 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Dados representativos de um ensaio residual K562 (CD3-CD16-CD56-CD71+). Abreviaturas: aAPC = célula que apresenta antígeno artificial; NK = célula assassina natural; SSC-A = área de dispersão lateral do pico; CD = cluster de diferenciação; IL = interleucina; TCR = receptor de células T; MCB =banco de células mestre; FMO = fluorescência menos um; DP = produto medicamentoso; WCB = banco de células de trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Etapas do processo Parâmetros Doadores Média St. Dev. Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Pós-Enriquecimento (Fração de Linfócito F2) As validações de processos da TVC foram semeadas em 109 TVC 1.00 X 109 1.00 X 109 1.00 X 109 1.00 X 109 0.00 Viabilidade (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 Células CD20+ B (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 Célula CD3+ T (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 Células CD3-CD56+CD16+ NK (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 Linhagem celular T e NK negativa (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tabela 1: Resumo do enriquecimento de linfócitos por elutriação relatado como frequência de células vivas. Abreviaturas: TVC = contagem total viável; TCR = receptor de células T; CD = cluster de diferenciação; NK = célula assassina natural. Etapas do processo Parâmetros Doadores Média St. Dev. Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Expansão do ácido pós-zoledrônico de 7 dias (esgotamento pré-TCRαβ) TVC 3.69 X 109 1.79 X 109 1.42 X 109 2.3 X 109 1.22 X 109 Viabilidade (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 Células CD20+ B 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 Célula CD3+ T (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 Células CD3-CD56+CD16+ NK (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 Linhagem celular T e NK negativa (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Esgotamento pós-TCRαβ TVC 1,81 x 109 4.95 X 108 3.80 X 108 8.95 X108 7.94 X 108 Viabilidade celular (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 Células CD20+ B 2.26 12 6.59 6.95 4.88 Célula CD3+ T (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 Células CD3-CD56+CD16+ NK (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 Linhagem celular T e NK negativa (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4.95 x 103 3.8 X 103 2.92 X 103 2.59 X 103 TCR γδ+ TVC 1.73 X 109 2.23 X 108 3.39 X 108 7.64 X 108 8.39 X 108 CD3-CD56+CD16+ NK TVC 6.97 X 107 2.97 X 108 3.72E+07 1.35 X 108 1.42 X 108 Tabela 2: Resumo da expansão celular γδ T com ácido zoledrônico e enriquecimento de instrumentos relatado como frequência de células vivas. Abreviaturas:TVC = contagem total viável; TCR = receptor de células T; CD = cluster de diferenciação; NK = célula assassina natural. Atributos do produto Parâmetros Doadores Média St. Dev. Corrida 1 Corrida 2 Corrida 3 Dia 0 γδ T Células 2.48 X 107 1.59 X 107 2.10 X 107 2.06 X 107 4.47 X 107 Dia 7 pós enriquecimento γδ T Cells 1.73 X 109 2.23 X 108 3.39 X 108 7.64 X 108 8.39 X 108 Expansão do Fold no dia 7 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC na colheita* 8.14 X 1010 1.67 X 1010 6.84 X 1010 5.55 X 1010 3.42 X 1010 Viabilidade celular (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 Células CD20+ B (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 Célula CD3+ T (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 Células CD3-CD56+CD16+ NK (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 Linhagem celular T e NK negativa, CD71+ Residual K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Células γδ t totais na Colheita 7.93 X 1012 8.38 X 1011 6.65 X 1012 5.14 X 1012 3.78 X 1012 Expansão total do fold de células γδ T (Do dia 0 à colheita) 3.20 X 105 5.27 X 104 3.17 X 105 2.30 X 105 1.53 X 105 *A validação do processo foi dimensionada para frasco com célula 5 X 106 γδ T e 50 AAPCs irradiados X106. Os números relatados são para uma corrida em escala total projetada se 24 frascos forem semeados da substância droga D7. Tabela 3: Resumo da co-cultura de células T γδ+ com aAPCs e expansão da colheita celular γδ+ T relatada como frequência de células vivas. *A validação do processo foi reduzido a um bioreator de sistema fechado (capacidade 1 L) com 5 × 106 células γδ T e 50 × 106 aAPCs irradiados. Os números relatados são para uma corrida projetada em larga escala se 24 frascos forem semeados da substância droga D7. Abreviaturas: aAPCs = células que apresentam antígenos artificiais; TVC = contagem total viável; TCR = receptor de células T; CD = cluster de diferenciação; NK = célula assassina natural. Parâmetro de teste Critérios de aceitação Resultados Validação 1 Validação 2 Validação 3 Viabilidade ≥ 70% 92.80% 85.50% 87.30% Micoplasma Negativo Negativo Negativo Negativo Esterilidade Sem Final de Crescimento (14 dias) Sem Final de Crescimento (14 dias) Sem Final de Crescimento (14 dias) Sem Final de Crescimento (14 dias) Mancha de grama Nenhum organismo visto (NOS) SAI SAI SAI Endotoxinas ≤ 2 EU/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL <0,50 EU/mL Tabela 4: Resumo dos resultados dos testes de liberação de controle de qualidade para as células γδ T. Ensaio residual K562 K562 WCB γδ Apenas γδ + Produto WCB Linhagem celular T e NK neg. % K562 residual % Linhagem celular T e NK neg. % K562 residual % Linhagem celular T e NK neg. % K562 residual % Linhagem celular T e NK neg. % K562 residual % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 N/A N/A 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 N/A N/A N/A N/A 98.7 98.3 98.6 97.6 N/A N/A N/A N/A Média 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 St. Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tabela 5: As porcentagens de linhagem de células T e NK negativas e residuais K562 relatadas como frequência de células vivas. Abreviaturas: NK = célula assassina natural; WCB = banco de células de trabalho.

Discussion

O Moffit Cell Therapy Lab desenvolveu um protocolo com uma expansão bifásica de células γδ T altamente puras para uso como DP em ensaios clínicos. Este protocolo fornece um método de fabricação sob as diretrizes cGMP em um sistema fechado que produz um DP de células γδ t altamente pura que é ativado e expandido com sucesso por ácido zoledrônico e os aAPCs WCB. Este protocolo foi aprovado pela FDA para a fabricação de um DP aogenético γδ T celular para pacientes com LMA. Usando doadores saudáveis, expandimos com sucesso a pequena população de células γδ T doadoras em apenas 7 dias, de 2,06 ± 0,45% para 54,45 ± 28,34%. Após a expansão de 7 dias com ácido zoledrônico, observou-se que o doador 2 apresentou aumento na população de NK.

O ácido zoledrônico inibe a distease de difosfato de farnésila (FDPS) em monócitos, o que, por sua vez, leva ao acúmulo de pirofosfato isocenil (IPP), que foi correlacionado com um aumento significativo na proliferação de células T e células NK naturais7,8,9. Esse aumento da população de NK dificulta a 2ª fase de expansão com os aAPCs, pois os aAPCs só contribuirão para a expansão das células NK. Por essa razão, os critérios de doadores foram modificados para excluir doadores com altas populações de NK. Após o esgotamento das células αβ T, as células γδ T foram enriquecidas para 76,61 ± 27,51%. Este protocolo único inclui uma segunda expansão utilizando os aAPCs fabricados pelo Moffit para atingir os receptores CD8, CD28 e CD127L nas células γδ T. Esta segunda fase de expansão com os aAPCs rendeu um DP com ≥65% para células T CD3+TCR γδ+, ≤1% TCRαβ T e <35% células CD3-CD16+CD56+ NK. Devido ao uso de aAPCs derivados do K562, foi necessário demonstrar que esses aAPCs constituíam <1% do produto final.

O Moffit CTF desenvolveu um ensaio citométrico de fluxo utilizado para os critérios de liberação para medir o percentual das células residuais K562 no DP final. Este ensaio citométrico de fluxo atenua todas as questões de utilização de antígenos da superfície celular para identificar as células K562. Como as células T ativadas podem expressar CD71, criamos uma estratégia para excluir todas as células T e células NK, gating em populações CD3-CD56 e CD16 e, em seguida, examinando as células CD71+, que seriam exclusivamente células K562. Este protocolo demonstra que a γδ T célula DP produz 0,48 ± 0,42% das células residuais de K562 e atende a todos os critérios de liberação de ≥ 70% de viabilidade, negatividade mycoplasma por PCR, nenhum organismo visto por coloração gramada, ≤2 EU/mL de endotoxina, e nenhum crescimento final (14 dias) de esterilidade da cultura sanguínea.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Prêmio de Testes Intramuros do Prêmio de Testes Intramuros do Moffitt Cancer Center por fornecer o financiamento para este desenvolvimento de protocolos. Agradecemos também ao Dr. Claudio Anasetti por sua inestimável ajuda e orientação através deste projeto. Finalmente, agradecemos ao Dr. Justin Boucher por suas ideias e revisão do manuscrito.

Materials

Hanks Balanced Salt Solution R&D 285-GMP
Human Albumin 25% Grifolis 65483-16-071
Plasmalyte A Fisher 2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa) Hos pira 4215-04–8 FDA approved drug
DMSO WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH WAK-DMSO-10
CS10 BIOLIFE SOLUTIONS 210374
3 mL syringe BD 309657
10 mL syringe BD 309604
20 mL syringe BD 302830
50 mL syringe BD 309653
100 mL syringe JMS 992861
18g Needle Fisher 305198
Cryovials 1.8 mL Fisher 375418
5 mL pipette Fisher 1367811D
50 mL pipette Fisher 1367610Q
10 mL pipette Fisher 1367811E
100 mL pipette Fisher 07-200-620
15 mL conical Fisher 05-539-12
50 mL conical Fisher 05-539-7
250 mL conical Fisher 430776
600 mL Transfer Pack TERUMO BCT INC 1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES 03-220-90
Elutra Tubing Set TerumoBCT 70800
100 MCS GREX WILSON WOLF MFG CORP 81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system Fisher Scientific 22-246660
Acacia Pump boot MPS Medical In 17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer Miltenyi Biotec Inc 130-070-525
Dornase Alpha Genentech, Inc 50242-100-40/186-0055 FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter Fisher 157-0020
Blood Filter 170um B.Braun V2500
CliniMACs Tubing set Miltenyi Biotec Inc 130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit Miltenyi Biotec Inc 130-021-301
Y-Type blood set Fenwal FWL4C2498H
75 mL Flask Fisher 430641U
IL-2 Prometheus 65483-116-071 FDA approved drug
AIM-V Fisher 0870112BK
Human AB serum Gemini Bio-Product 100H41T
3 Liter Transfer pack Independent Medical Associates T3109
1000  pipette tips Fisher Scientific 5991040
CF-250 KOLBio CF-250
Elutra TERUMOBCT
CliniMACS Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
  2. Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
  3. Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
  4. Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
  5. Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
  6. Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
  7. Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
  8. Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
  9. Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).

Tags

Gamma-delta T CellsCytotoxic ActivityCancerAcute Myeloid LeukemiaExpansionEnrichmentApheresisCell TherapyElutriationCell CultureBioreactorZoledronic AcidIL-2Flow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Landin, A. M., Cox, C., Yu, B., Bejanyan, N., Davila, M., Kelley, L. Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (γδ) T Cells from Apheresed Human Product. J. Vis. Exp. (175), e62622, doi:10.3791/62622 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image