JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Published: September 22, 2021
doi:
10.3791/62622
, , , , ,
1Cell Therapy Facility,Moffitt Cancer Center and Research Institute, 2Department of Immunology,Moffitt Cancer Center and Research Institute

Summary

Sunulan Gama-Delta (φδ) T hücreli ilaç ürününün genişletilmesi için bir protokoldür. Lenfositler elütriasyon ile izole edilir ve zoledronik asit ve interlökin-2 ile zenginleştirilir. Alfa-beta T hücreleri klinik sınıf manyetik ayırma cihazı kullanılarak tükeniyor. δδ hücreleri K562 türevi, yapay antijen sunan hücrelerle birlikte kültürlenir ve genişletilir.

Abstract

Vφ9Vδ2 T hücreleri T lenfositlerinin küçük bir alt kümesi olmasına rağmen, bu popülasyon antijenleri büyük bir histocompabilite kompleksinde (MHC) bağımsız bir şekilde tanıma ve kanser immünoterapisi için ideal bir aday haline getiren güçlü sitolitik efektör fonksiyonu geliştirme yeteneği için aranmaktadır. Periferik kandaki Gama-Delta (φδ) T hücrelerinin düşük sıklığı nedeniyle, akut miyeloid lösemi (AML) hastalarında allogeneik δδ T hücrelerinin insanda ilk kullanımı için son derece saf bir φδ T hücreleri ilaç ürününü büyük ölçüde genişletmek için etkili bir protokol geliştirdik. Allojenik bir hücre kaynağı olarak sağlıklı donör aferez kullanılarak, lenfositler hücreleri boyut ve yoğunluğa göre ayırmanın karşı akış santrifüjleme yöntemi için doğrulanmış bir cihaz kullanılarak izole edilir.

Lenfosit bakımından zengin fraksiyon kullanılır ve δ T hücreleri tercihen zoledronik asit (FDA onaylı) ve interlökin (IL)-2 ile 7 gün boyunca aktive edilir. φδ T hücrelerinin tercihli genişlemesinden sonra, kirletici T hücre reseptörü (TCR)αβ T hücrelerini tükenmek için klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazı ve TCRαβ boncukları kullanılır. Yüksek oranda zenginleştirilmiş φδ T hücreleri daha sonra CD3 ve CD28, 41BBL (CD137L) ve IL15-RA-ile zoledronik asit ve IL-2 için tek zincirli değişken parçayı (scFv) ifade etmek üzere genetik olarak tasarlanmış K562 hücrelerinden (AAPC’ ler) türetilen tasarlanmış yapay antijen sunum hücreleri (AAPC’ler) kullanılarak ikinci bir genişlemeden geçer. Tüm gün-7 zenginleştirilmiş φδ T hücrelerinin aAPC’lerle birlikte üretilmesi, sağlıklı donör kanından ortalama 229.000 kat > kat genişlemesi ile son derece saf φδ T hücrelerinin üretimini kolaylaştırır.

Introduction

Lösemi nüks, AML1,2,3 hastalarında hematopoetik hücre nakli (HCT) sonrası mortalitenin önde gelen nedenidir. Daha iyi lösemisiz sağkalım, HCT sonrası kan φδ T hücrelerinin grefte karşı Konak Hastalığı (GVHD)4 riski olmadan iyileşmesinin artmasıyla bildirilmiştir. φδ T hücrelerinin antijenleri MHC’den bağımsız bir şekilde tanıma ve güçlü sitolitik ve Th1 benzeri efektör fonksiyonlar geliştirme yeteneği, T hücrelerinin bu küçük alt nüfusunu nüks riski altındaki allogeneik transplantasyon geçiren AML hastalarının tedavisi için ideal hale getirmektedir5. Vφ9Vδ2 T hücrelerinin, çevre6’daki T hücrelerinin% 0,5 ila% 5’i arasında değişen küçük bir T lenfosit alt kümesi olduğu göz önüne alındığında, klinik çalışmalar için potansiyel olarak terapötik dozlar elde etmek için bu nadir kan hücresi popülasyonunu genişletmek için sağlam bir sistem kurmak için yola çıktık.

Diğerleri zoledronik asit ve hatta aAPC’ler kullanarak φδ T hücrelerini başarıyla genişletmiş olsa da, φδ T hücrelerini potansiyel olarak 229.749 kat genişletebilen bir süreç geliştirdik. Genişleme bifaziktir: ilk olarak, lenfositler ayırma aleti kullanılarak elutriasyon ile elde edilir. Ekipman, hücrelerin boyutlarına, şekillerine ve yoğunluklarına göre ters akış santrifüjleme ile ayrılmasını sağlayan kapalı bir sistem sağlar. Lenfositler için zenginleştikten sonra, Vφ9Vδ2 T hücrelerinin seçici genişlemesi zoledronik asit ve IL-2 ile 7 gün boyunca tedavi ile elde edilir. Bu tedaviden hemen sonra, TCR-αβ T hücreleri mikrobead teknolojisi kullanılarak tükenerek K562 türevi aAPC’lerle δδ T hücrelerinin daha sonra genişlemesine izin verilir.

Proses doğrulaması için, aAPC’lerle faz-2 ortak kültür genişlemesi için sadece 5 × 106 zoledronik asit genişletilmiş φδ T hücresi kullanıldı. Genişlemenin bu ikinci aşamasında, φδ T hücreleri, Moffitt’te üretilen genetik olarak tasarlanmış K562 türevi aAPC’lerin (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) uyumlu Çalışma Hücresi Bankası (WCB) kullanılarak etkinleştirilir. Bu bifazik genişlemenin mantığı, zoledronik asidin monositlerde farnesil difosfat sintazını (FDPS) inhibe etme yeteneğine dayanır ve Vφ2Vδ2 hücrelerini doğrudan uyaran izopentenil pirofosfat birikimine yol açmaktadır. Genişlemenin ikinci aşamasında, K562 türevli aAPC’ler (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) tüm T hücrelerine sağlam bir uyarım sağlar. Bununla birlikte, hücre ürünü zaten φδ T hücreleri için zenginleştirilmiştir, bu da φδ T hücrelerinin sağlam bir şekilde genişlemesine neden olur.

Belirli ekipman ve şişelerin kullanımıyla, işlem işlevsel olarak kapalı bir sistemdir, böylece kontaminasyon riskini azaltır. Ek olarak, 1 L kapalı sistem biyoreaktör, minimum beslenme ihtiyacı ile toplam 1 L orta hacimde hücrelerin maksimum büyümesini ve genişlemesini kolaylaştırır. Moffitt yönteminin avantajı, allogeneik uygulama için son derece saf, donör türevi bir φδ T hücre ürünü üretmek için hızlı, tekrarlanabilir ve son derece uygulanabilir bir GMP sistemi sağlamasıdır. Bu yöntem, kısmi ve tam remisyonlu kanser hastalarında mikroplara ve tümörlere karşı bağışıklığa aracılık etmek için Vφ2Vδ2 T hücre reseptörlerini benimseyen immünoterapi olarak ifade eden insan δδ T hücrelerini kullanmayı amaçlayan herhangi bir klinik çalışmaya uygulanabilir. Ek olarak, δ oksimerik antijen reseptörü pozitif (CAR+) T hücrelerinin geliştirilmesi ve üretimi için sağlam bir platform sağlar.

Protocol

NOT: IRB onayı alınmış, bağışçılardan bilgilendirilmiş onay alınmıştır. 1. Lenfosit izolasyonu Aferez ürününü temiz bir odaya aktarın.NOT: Proses doğrulaması, ham hücresel malzeme toplama yönetmeliklerine uygun harici bir ticari satıcıdan normal donör aferez kullanılarak gerçekleştirildi. Sterilite testi, hücre sayısı ve hücre fenotipleme için örnekler toplayın. %1 insan serum albümini (HSA) ve ikincil bir salin çözeltisi (%0,9 sodyum klorür Enjeksiyon USP) veya Dulbecco’nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi birincil ortamı kullanarak karşı akış santrifüjleme cihazında elütriat. Elütriasyon santrifüjleme hızını 900 × g olarak ayarlayın ve akış hızına ve zamana göre kesirleri toplayın. Kesir 2’den numuneleri toplayın ve aşağıdaki testleri yapın: sterilite testi için 2 mL; Acridine turuncu/propidium iyodür (AO/PI) kullanılarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi ile hücre fenotipleme için 5 × 106 hücre. 5 μmol/L zoledronik asit ve 300 IU/mL IL-2 ile 1 L kapalı sistem biyoreaktörde 10 × 106 hücre/cm2’de kültürdeki hücrelerin saf lenfosit fraksiyonunu (fraksiyon 2) genişletin. %5 CO2 ile 37 °C’de ayarlanmış bir inkübatörde yedi gün kuluçkaya yatır. 2. Alfa-beta (αβ) T hücre tükenmesi 1 L kapalı sistem biyoreaktör şişesinden hücreleri toplar. Kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L’lik bir transfer paketi steril kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için uygun farmasötik pompayı kullanın. Aşağıdaki örnekleri alın: harcanan orta sterilite için 10 mL; AO/PI kullanarak hücre sayısı ve canlılık için 0,5 mL hücre; Akış sitometrisi için 5 × 106 hücre Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) veya (PBS/etylenediaminetetraasetik asit (EDTA)) tampon + %0,5 HSA ve biyotinilasyonlu TCR αβ spesifik antikorda ~5 × 108 hücre/mL’de yeniden biriktirin. Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C’de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın. Hücreleri toplam 600 mL PBS/EDTA tampon + %0,5 HSA ile yıkayın. 200-500 × g’daki ilişkisiz antikorun 2-8 °C’de 15 dakika boyunca çıkarılması için santrifüj. PBS/EDTA tamponunda ~5 × 108 hücre/mL + anti-biotin spesifik mikrobeadlarla (7,5 mL/1 şişe) %0,5 HSA’yı yeniden biriktirin. Çalkalayıcıyı buzdolabına yerleştirin ve hücreleri 2-8 °C’de yaklaşık 15 dakika sallanarak kuluçkaya yatırın. kuluçkadan sonra, sınırsız mikropları çıkarmak için hücreleri 200-500 × g’da 2-8 ° C’de 15 dakika santrifüj edin. PBS/EDTA tamponu + %0,5 HSA’da ~6 × 107 hücre/mL’yi yeniden biriktirin ve bir transfer paketi torbasına aktarın. Boru setini üreticinin talimatlarına uyarak klinik sınıf manyetik hücre ayırma cihazına takın, paketleri PBS/EDTA tamponu ve transfer paketini hücre ürünü ile birlikte cihaza yerleştirin ve cihaz tarafından talimat verildiğinde çivileyin. Etiketli αβ T hücrelerinin tükenmesi için Tükenme 1.2 protokolünü seçin. Hedef fraksiyonu (zenginleştirilmiş φδ T hücreleri) santrifüj edin ve hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ortamda yeniden biriktirin. 0,5 mL’lik bir örnek alın ve AO/PI lekesi ile hücre sayısı ve canlılık gerçekleştirin. Hücreleri yaklaşık 1 × 106 hücre/mL’lik son konsantrasyona getirin. Akış sitometri fenotipleme sonrası tükenme için ürünün 5 × 106 hücresinden bir örnek alın. 3. AAPC’lerle ortak kültür X-ray üreten cihaza 100 Gy’de 5 × 107 aAPC/matara ışınlayın. AAPC’leri φδ T hücreleriyle 10:1 oranında birlikte kültür içinde kullanın. Işınlanmış aAPC’leri (5 × 107 hücre/şişe) ve φδ T hücrelerini (5 × 106 hücre/şişe) insan AB serumu ile desteklenmiş 1 L kültür ortamına sahip 1 L kapalı sistem biyoreaktör şişelerine yerleştirin. 10 şişeye kadar tohum. 37 °C ve %5 CO2’de bir inkübatörde 10 gün boyunca kültürdeki hücreleri genişletin. Şeritler, glikoz ve laktat ölçer kullanarak her 3-4 günde bir glikoz ve laktat seviyelerini izleyin. Glikoz 250 mg/dL’ye düşerse, kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine 1 L’lik bir transfer paketini steril kaynak yaparak bir farmasötik pompa kullanarak şişedeki hacmi 200 mL’ye düşürün. Kalan 200 mL’deki hücreleri karıştırın ve AO-PI boyama ile hücre sayımı ve canlılık ölçümü için 0,5 mL’lik bir örnek alın. Hücre sayısı ≥109 ise, bir şişeyi iki şişeye bölün ve her şişeyi% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş AIM-V ile 1 L’ye kadar doldurun. Hücre sayısı <109 ise, hücreleri% 10 insan AB serumu ile desteklenmiş taze bir litre kültür ortamı ile besleyin. Tüm şişeler için 3.6 adımını tekrarlayın ve 37 °C ve% 5 CO2’de inkübatöre geri verin. 3,4-3,7 arası adımları her 3 ila 4 günde bir yineleyin. 4. Hücre hasadı Ortak kültürde 10 günün sonunda, tüm biyoreaktör şişelerini hasat edin. Bir seferde 1 biyoreaktör şişesi hasat edin ve tüm hücreleri uygun boyutta bir transfer paketine toplayın. Transfer paketini kapalı sistem biyoreaktörün kırmızı çizgisine steril olarak kaynaklayın ve hücreleri transfer paketine aktarmak için farmasötik pompayı kullanın. Aşağıdaki kalite kontrol örneklerini çıkarın: kan kültürü ve gram boyama ile sterilite için ilaç ürününün (DP)% 1’i; AO/PI kullanarak hücre sayımı ve canlılık için 0,5 mL; Akış sitometrisi için 5-10 × 106 hücre (gating stratejisi için Şekil 1’e bakın); Endotoksin için 0,5 mL; Gram boyama için 0,5 mL; Mycoplasma testi için 106 hücre 10 mL harcanan ortama yükseldi. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 200-500 × g’da santrifüj edin ve üst yapıyı atın. Hücreleri dengeli kristaloid çözelti çözeltisi + 200-500’de% 0,5 HSA × g oda sıcaklığında 15 dakika yıkayın. Bunları 100-300 mL dengeli kristaloid çözelti + % 0,5 HSA hedef hacminde yeniden kullanın. 5. Sürüm testi Aşağıdakiler için δδ T hücresi DP’nin kalite kontrol testini gerçekleştirin: akış sitometrisine göre saflık ve kimlik (Canlı/ Ölü, CD45, CD3, TCR αβ, TCR φδ, CD20, CD56, CD16); AO/PI boyama ile uygulanabilirlik; endotoksin; Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile mikoplazma testi; gram boyama ve aerobik ve anaerobik kan kültürleri ile sterilite; kalıntı K562, akış sitometrisine göre test edilir (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

δδ T hücre süreci, δδ T hücreli ilaç ürününün üretimi için karakterize edildi ve optimize edildi. Proses optimizasyonu dahil 1) elütriasyon kullanılarak lenfosit zenginleştirme, 2) zoledronik asit ile φδ T hücreli ilaç maddesi (DS) hücreye özgü genleşme, 3) φδ T hücre DS’nin TÜKENMEsi TCRαβ, 4) K562 türevi aAPC’ler kullanılarak φδ T hücre DS’nin ikincil genişlemesi ve 5) son DP hasadı ve uygulama veya kriyoprezervasyon için ürünün formülasyonu. Proses optimizasyonundan sonra, hücre işleme uygunluğunu doğrulamak için üç sağlıklı donörden elde edilen malzeme kullanılarak uygun ölçekte onay çalıştırmaları gerçekleştirildi. Tüm veriler analiz edildi ve Tablo 1, Tablo 2 ve Tablo 3’te özetlenmiştir. Karşı akış sonrası santrifüj fraksiyonu 2’den (F2) ayrılan hücreler, ortalama ,23 CD45+ hücre (toplam canlı kapı sıklığı olarak bildirilmektedir) ve mükemmel ortalama canlılık ,80 (Tablo 1) ile saf lenfosit popülasyonu elde etti. Zoledronik asit ile δδ T hücreye özgü genleşme, elütriasyondan sonra lenfosit fraksiyonunda (F2) bulunan doğal öldürücü (NK) hücrelerin başlangıç yüzdesine bağlı olarak ortaya çıktı. φδ T hücre DS’nin TCRαβ tükenmesi ile zenginleştirilmesi tutarlıydı (Tablo 2). Üç sağlıklı donörden üretilen δδ T hücre DP’si ortalama %0,11 ± %0,05 CD20+ B hücresine ve %0,00 ± %0,00 TCR αβ+ T hücrelerine sahipti ve böylece TCR αβ+ T hücrelerinin %≤1’inin salınım kriterini karşılıyordu. Nihai üründeki NK hücrelerinin ortalama yüzdesi ,06 ± ,19’dur ve ‘< serbest bırakma kriterini karşılar. Ayrıca nihai üründeki T hücresi ve NK hücre soyu negatif hücrelerin ortalama yüzdesi %0,48 ± %0,42 idi (Tablo 3). Şekil 2A-D’de gösterildiği gibi DS ve DP’nin kimliğini, saflığını ve proses saflıklarını karakterize etmek için hücre yüzeyi boyama ve akış sitometrik analizi kullanılmıştır. AAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB ve φδ T hücre DS’nin ortak kültüründen 10:1 oranında elde edilen ikincil genişleme, Tablo 4’te gösterildiği gibi tüm serbest bırakma kriterlerini karşılayan bir φδ T hücre DP’si oluşturdu. Ek olarak, hücreler Gün 0-karşı akış santrifüjleme F2 hücrelerinde akış sitometrisi ile boyanmış ve değerlendirilmiş, Gün 7-zoledronik asit genişletilmiş T hücreleri, Gün 7-TCR αβ T hücre tükenmesi, Aşağıdaki biyobelirteçler farklılaşma kümesi için 17-son DP (CD)3, TCRαβ, TCR φδ, CD45RA, CD45RO, CC kemokilen reseptör 7 (CCR7), programlanmış hücre ölüm proteini-1 (PD-1), sitotoksik T lenfosit ilişkili protein 4 (CTLA4), lenfosit aktive edici gen 3 (LAG3) ve T hücre immünoglobulin ve musin alan adı içeren protein 3 (TIM3). Şekil 3’te gösterilen veriler üç bağımsız çalıştırmadan ortalamadır ve hücrelerin tükenmeye ulaşmadığını gösterir. Moffitt CTF ayrıca K562 türevli aAPC’lerle ilgili DP safsızlıklarını belirlemek için artık bir K562 tahlili geliştirmiştir (Şekil 4). Hücre tiplerinin yüzdelerini karakterize etmek için kullanılan akış sitometrik gating stratejisi şu şekildeydi: 1) T ve NK hücre soyu negatif popülasyonu (CD3-CD56-CD16-) üzerinde gating; 2) CD71+ üzerindeki kapı (eritroid soyunda ifade edilen transferrin reseptörü ve artık K562 hücrelerinin tespitini sağlayan AML). Bu gating stratejisi, aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (Şekil 4’te “artık K562” olarak adlandırılan) olan CD3-CD16-CD56-CD71+ hücrelerinin değerlendirilmesini sağladı. Bu gating, son DP’de kalan K562’nin, kalan K562 frekansını DP’nin toplam uygulanabilir sayısı (TVC) sayısıyla (71+ × DP TVC = DP’deki artık K562 hücreleri) çarparak numaralandırılmasına izin verir. Tüm akış sitometrik verileri canlı hücrelerin frekansı olarak bildirilmektedir. Tablo 5 ve Şekil 4, T hücresi ve NK hücre soyunun negatif ve artık K562 hücrelerinin yüzdelerini sağlar. Bu popülasyonlar arasındaki farkların istatistiksel önemini belirlemek için iki kuyruklu bir t-testi yapıldı ve WCB ve δδ T hücre DP ile WCB ve φδ T hücreleri arasında anlamlı bir fark olduğunu ortaya koydu (T hücresi ve NK hücre soyu için t = 0.0019; t < Kalan K562 için 0.0001 ve T hücresi ve NK hücre soyu negatif için t = 0.0314; t < 0.0001 Artık K562 için) (Tablo 5). Şekil 1: Akış sitometrik gating stratejisinin şematik gösterimi. Kısaltmalar: aAPC = , yapay antijen sunan hücre; SSC-A = tepenin yan dağılım alanı; FSC-A = tepenin ileri dağılım alanı; SSC-H = tepenin yan dağılım yüksekliği; FSC-H = tepenin ileri dağılım yüksekliği; CD = farklılaşma kümesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Başlangıç Malzemesi, Ara Ve Nihai İlaç Ürününün Bileşimi. Gösterilen tüm verilerin ortalaması üç bağımsız çalıştırmadan elde edilir. (A) Sağlıklı donörlerden aferez, karşı akış santrifüjleme cihazı kullanılarak elütriasyona uğrar ve başlangıç malzemesi olarak kullanılan F2 (lenfosit bakımından zengin fraksiyon) ile sonuçlanır. (B) F2, 5 μmol/L zoledronik asit ve 300 IU/mL IL-2 in 1 L orta ile 7 gün boyunca Vφ9Vδ2 T hücreye özgü genişlemeden geçer. (C) Zoledronik asitle genişletilen üründe TCR αβ T hücre tükenmesi gerçekleştirilir. (D) Son derece saf bir φδ T hücreli İlaç Ürünü, ışınlanmış aAPC’ler ile 1:10 oranında 5 μmol / L zoledronik asit ve 300 IU / mL IL-2’nin 1 L’de 10 insan AB serumu ile desteklenmiş ikinci bir 10 günlük genişlemeden sonra hasat edilir. Kısaltmalar: NK = doğal katil; CD = farklılaşma kümesi; TCR= T hücre reseptörü; IL = interleukin; aAPCs = yapay antijen sunan hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Başlangıç Malzemesi, Ara Ve Nihai İlaç Ürününün Biyobelirteçleri. Hücreler CD3, TCRαβ, TCR δ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 ve TIM3 için 0-Counterflow Santrifüjasyon F2 hücreleri, Gün 7-zoledronik asit genişletilmiş T hücreleri, Gün 7-TCR αβ T hücre tükenmesi, 17-Son İlaç Ürünü için toplanır ve lekelenir. Gösterilen tüm verilerin ortalaması üç bağımsız çalıştırmadan elde edilir. (A) Toplam canlı hücre sayısı olarak gösterilen gövde benzeri (CD3+, TCR φδ+, CD45RA+, CD45RO-ve CCR7+). (B) CD3+ TCR φδ+ hücrelerinin yüzdesi olarak gösterilen merkezi bellek (CD3+, TCR φδ+, CD45RA-, CD45RO+ve CCR7+). Kısaltmalar: CD = farklılaşma kümesi; TCR= T hücre reseptörü; IL = interleukin; . CCR7 = CC kemokin reseptörü 7; PD-1 = programlanmış hücre ölüm proteini-1; CTLA4 = sitotoksik T lenfosit ilişkili protein 4; LAG3 = lenfosit aktive edici gen 3; TIM3 = T hücre immünoglobulin ve mucin alan adı içeren protein 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: K562 kalıntı tahlilinin temsili verileri (CD3-CD16-CD56-CD71+). Kısaltmalar: aAPC = yapay antijen sunan hücre; NK = doğal öldürücü hücre; SSC-A = tepenin yan dağılım alanı; CD = farklılaşma kümesi; IL = interleukin; TCR = T hücre reseptörü; MCB =ana hücre bankası; FMO = floresan eksi bir; DP = ilaç ürünü; WCB = çalışan hücre bankası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. İşlem Adımları Parametre Bağış Ortalama Aziz Dev. Çalıştır 1 Çalıştır 2 Çalıştır 3 Post-Enrichment (Lenfosit fraksiyonu F2) TVC Tüm Süreç Doğrulamaları 109 TVC’de tohumlandı 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 1,00 X 109 0.00 Yaşanabilirlik (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 CD20+ B hücreleri (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 CD3+ T hücresi (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR φδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 CD3-CD56+CD16+ NK hücreleri (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 T hücresi ve NK hücre soyu negatif (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tablo 1: Canlı hücre sıklığı olarak bildirilen elütriasyon ile lenfosit zenginleştirme özeti. Kısaltmalar: TVC = toplam uygulanabilir sayı; TCR = T hücre reseptörü; CD = farklılaşma kümesi; NK = doğal katil hücre. İşlem Adımları Parametre Bağış Ortalama Aziz Dev. Çalıştır 1 Çalıştır 2 Çalıştır 3 7 günlük Post Zoledronik asit Genişlemesi (TCRαβ öncesi tükenme) TVC 3,69 X 109 1,79 X 109 1,42 X 109 2,3 X 109 1,22 X 109 Yaşanabilirlik (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 CD20+ B hücreleri 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 CD3+ T hücresi (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR φδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 CD3-CD56+CD16+ NK hücreleri (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 T hücresi ve NK hücre soyu negatif (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Post- TCRαβ tükenmesi TVC 1,81 x 109 4,95 X 108 3,80 X 108 8,95 X108 7,94 X 108 Hücre canlılığı (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 CD20+ B hücreleri 2.26 12 6.59 6.95 4.88 CD3+ T hücresi (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR φδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 CD3-CD56+CD16+ NK hücreleri (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 T hücresi ve NK hücre soyu negatif (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4,95 x 103 3,8 X 103 2,92 X 103 2,59 X 103 TCR φδ+ TVC 1,73 X 109 2,23 X 108 3,39 X 108 7,64 X 108 8,39 X 108 CD3-CD56+CD16+ NK TVC 6,97 X 107 2,97 X 108 3.72E+07 1,35 X 108 1,42 X 108 Tablo 2: Canlı hücrelerin sıklığı olarak bildirilen zoledronik asit ve enstrüman zenginleştirme ile δδ T hücre genişlemesinin özeti. Kısaltmalar:TVC = toplam uygulanabilir sayı; TCR = T hücre reseptörü; CD = farklılaşma kümesi; NK = doğal katil hücre. Ürün Öznitelikleri Parametre Bağış Ortalama Aziz Dev. Çalıştır 1 Çalıştır 2 Çalıştır 3 Gün 0 φδ T Hücreleri 2,48 X 107 1,59 X 107 2,10 X 107 2,06 X 107 4,47 X 107 7. Gün sonrası zenginleştirme φδ T Hücreleri 1,73 X 109 2,23 X 108 3,39 X 108 7,64 X 108 8,39 X 108 7. Günde Katlama Genişletmesi 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC hasatta* 8,14 X 1010 1,67 X 1010 6,84 X 1010 5,55 X 1010 3,42 X 1010 Hücre canlılığı (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 CD20+ B hücreleri (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 CD3+ T hücresi (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR φδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 CD3-CD56+CD16+ NK hücreleri (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 T hücresi ve NK hücre soyu negatif, CD71+ Kalıntı K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Hasatta toplam φδ T hücreleri 7,93 X 1012 8,38 X 1011 6,65 X 1012 5,14 X 1012 3,78 X 1012 φδ T hücrelerinin Toplam Kat Genişlemesi (0. günden Hasada kadar) 3,20 X 105 5,27 X 104 3,17 X 105 2,30 X 105 1,53 X 105 *Proses Doğrulama, 5 X 106 δδ T hücresi ve 50 X106 ışınlanmış aAPC’ler ile şişeye kadar ölçeklendirildi. Bildirilen sayılar, D7 uyuşturucu maddesinden 24 şişe tohumlanmışsa öngörülen tam ölçekli bir çalışma içindir. Tablo 3: AAPC’ler ile δδ+ T hücre ortak kültürünün özeti ve canlı hücrelerin sıklığı olarak bildirilen genişletilmiş δδ+ T hücre hasadı. *Proses doğrulaması, 5 × 106 φδ T hücresi ve 50 × 106 ışınlanmış aAPC ile bir kapalı sistem biyoreaktörüne (1 L kapasitesi) ölçeklendirildi. Bildirilen sayılar, D7 uyuşturucu maddesinden 24 şişe tohumlanırsa öngörülen tam ölçekli bir çalışma içindir. Kısaltmalar: aAPC’ler = yapay antijen sunan hücreler; TVC = toplam uygulanabilir sayı; TCR = T hücre reseptörü; CD = farklılaşma kümesi; NK = doğal katil hücre. Test Parametresi Kabul Kriterleri Sonuç -ları Doğrulama 1 Doğrulama 2 Doğrulama 3 Canlılık ≥ 92.80% 85.50% 87.30% Mikoplazma Negatif Negatif Negatif Negatif Kısır -lık Büyüme Finali Yok (14 gün) Büyüme Finali Yok (14 gün) Büyüme Finali Yok (14 gün) Büyüme Finali Yok (14 gün) Gram lekesi Hiçbir organizma görülmedi (NOS) NOS NOS NOS Endotoksin ≤ 2 AB/mL <0,50 AB/mL <0,50 AB/mL <0,50 AB/mL Tablo 4: δδ T hücreleri için kalite kontrol serbest bırakma test sonuçlarının özeti. Kalıntı K562 Tahlil K562 WCB Yalnızca φδ δδ + WCB Ürünü T ve NK hücre hattı neg. Kalan K562 % T ve NK hücre hattı neg. Kalan K562 % T ve NK hücre hattı neg. Kalan K562 % T ve NK hücre hattı neg. Kalan K562 % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 YOK YOK 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 YOK YOK YOK YOK 98.7 98.3 98.6 97.6 YOK YOK YOK YOK Ortalama 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 Aziz Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tablo 5: Canlı hücre sıklığı olarak bildirilen T hücresi ve NK hücre soyu negatif ve kalıntı K562 yüzdeleri. Kısaltmalar: NK = doğal öldürücü hücre; WCB = çalışan hücre bankası.

Discussion

Moffit Hücre Terapi Laboratuvarı, klinik çalışmalarda DP olarak kullanılmak üzere son derece saf φδ T hücrelerinin bifazik genişlemesi ile bir protokol geliştirmiştir. Bu protokol, zoledronik asit ve WCB aAPC’ler tarafından başarıyla etkinleştirilen ve genişletilen son derece saf bir φδ T hücre DP’si veren kapalı bir sistemde cGMP yönergeleri altında bir üretim yöntemi sağlar. Bu protokol, AML hastaları için allogeneik δ t hücre DP’si üretimi için FDA tarafından onaylanmıştır. Sağlıklı donörler kullanarak, donör φδ T hücrelerinin küçük popülasyonu sadece 7 günde 2,06’dan %0,45’± 54,45’e ± %28,34’e başarıyla genişlettik. Zoledronik asit ile 7 günlük genişlemeden sonra donör 2’nin NK popülasyonunda artış olduğu gözlendi.

Zoledronik asit, monositlerde farnesil difosfat sintazını (FDPS) inhibe eder ve bu da T hücrelerinin ve doğal NK hücrelerinin çoğalmasında önemli bir artışla ilişkili olan izopentenil pirofosfatın (IPP) birikmesine yol açar7,8,9. Bu artan NK popülasyonu, AAPC’ler yalnızca NK hücrelerinin daha fazla genişlemesine katkıda bulunacağından, AAPC’lerle genişlemenin 2. Bu nedenle, donör kriterleri yüksek NK popülasyonu olan bağışçıları hariç tutacak şekilde değiştirilmiştir. αβ T hücrelerinin tükenmesi sonrasında δδ T hücreleri %27,51 ± 76,61’e zenginleştirilmiştir. Bu benzersiz protokol, φδ T hücrelerindeki CD8, CD28 ve CD127L reseptörlerini hedeflemek için Moffit tarafından üretilen aAPC’leri kullanan ikinci bir genişletme içerir. AAPC’lerle yapılan bu ikinci genişleme aşaması, CD3+TCR φδ+ T hücreleri için %65, ≤1 TCRαβ T ve %<35 CD3-CD16+CD56+ NK hücreleri için %≥65 dp verdi. K562 türevi aAPC’lerin kullanımı nedeniyle, bu APC’lerin nihai ürünün% 1’ini <1'ini oluşturduğunu göstermek gerekiyordu.

Moffit CTF, son DP’deki artık K562 hücrelerinin yüzdesini ölçmek için serbest bırakma kriterleri için kullanılan bir akış sitometrik testi geliştirdi. Bu akış sitometrik tahlili, K562 hücrelerini tanımlamak için hücre yüzey antijenlerinin kullanılmasıyla ilgili tüm sorunları azaltır. Aktif T hücreleri CD71’i ifade edebildiği için, CD3– CD56 ve CD16– popülasyonlarını eleyerek ve daha sonra sadece K562 hücreleri olacak CD71+ hücrelerini inceleyerek tüm T hücrelerini ve NK hücrelerini dışlamak için bir strateji tasarladık. Bu protokol, δδ T hücre DP’sinin artık K562 hücrelerinin% 0.48’ini ± 0.42 verdiğini ve %≥70 canlılık, PCR ile Mycoplasma olumsuzluğu, gram boyama ile görülen organizmalar, ≤2 AB/mL endotoksin ve büyüme finali (14 gün) kan kültürü sterilitesinin tüm salınım kriterlerini karşıladığını göstermektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu protokol geliştirme için finansman sağladığı için Moffitt Kanser Merkezi’nden Hücresel İmmünoterapiler-Araştırmacı Başlatılan Denemeler Ödülü Intramural Finansman Fırsatı’na teşekkür ediyoruz. Dr. Claudio Anasetti’ye de bu projedeki paha biçilmez yardımları ve rehberliği için teşekkür ederiz. Son olarak, Dr. Justin Boucher’e makale hakkındaki görüşleri ve incelemesi için teşekkür ederiz.

Materials

Hanks Balanced Salt Solution R&D 285-GMP
Human Albumin 25% Grifolis 65483-16-071
Plasmalyte A Fisher 2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa) Hos pira 4215-04–8 FDA approved drug
DMSO WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH WAK-DMSO-10
CS10 BIOLIFE SOLUTIONS 210374
3 mL syringe BD 309657
10 mL syringe BD 309604
20 mL syringe BD 302830
50 mL syringe BD 309653
100 mL syringe JMS 992861
18g Needle Fisher 305198
Cryovials 1.8 mL Fisher 375418
5 mL pipette Fisher 1367811D
50 mL pipette Fisher 1367610Q
10 mL pipette Fisher 1367811E
100 mL pipette Fisher 07-200-620
15 mL conical Fisher 05-539-12
50 mL conical Fisher 05-539-7
250 mL conical Fisher 430776
600 mL Transfer Pack TERUMO BCT INC 1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES 03-220-90
Elutra Tubing Set TerumoBCT 70800
100 MCS GREX WILSON WOLF MFG CORP 81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system Fisher Scientific 22-246660
Acacia Pump boot MPS Medical In 17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer Miltenyi Biotec Inc 130-070-525
Dornase Alpha Genentech, Inc 50242-100-40/186-0055 FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter Fisher 157-0020
Blood Filter 170um B.Braun V2500
CliniMACs Tubing set Miltenyi Biotec Inc 130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit Miltenyi Biotec Inc 130-021-301
Y-Type blood set Fenwal FWL4C2498H
75 mL Flask Fisher 430641U
IL-2 Prometheus 65483-116-071 FDA approved drug
AIM-V Fisher 0870112BK
Human AB serum Gemini Bio-Product 100H41T
3 Liter Transfer pack Independent Medical Associates T3109
1000  pipette tips Fisher Scientific 5991040
CF-250 KOLBio CF-250
Elutra TERUMOBCT
CliniMACS Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
  2. Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
  3. Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
  4. Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
  5. Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
  6. Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
  7. Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
  8. Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
  9. Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).

Tags

Gamma-delta T CellsCytotoxic ActivityCancerAcute Myeloid LeukemiaExpansionEnrichmentApheresisCell TherapyElutriationCell CultureBioreactorZoledronic AcidIL-2Flow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Landin, A. M., Cox, C., Yu, B., Bejanyan, N., Davila, M., Kelley, L. Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (γδ) T Cells from Apheresed Human Product. J. Vis. Exp. (175), e62622, doi:10.3791/62622 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image