JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Расширение и обогащение гамма-дельта (γδ) Т-клеток из аферезированного продукта человека

Published: September 22, 2021
doi:
10.3791/62622
, , , , ,
1Cell Therapy Facility,Moffitt Cancer Center and Research Institute, 2Department of Immunology,Moffitt Cancer Center and Research Institute

Summary

Представлен протокол расширения гамма-дельта (γδ) Т-клеточного лекарственного препарата. Лимфоциты выделяют элютрированием и γδ-обогащают золедроновой кислотой и интерлейкином-2. Альфа-бета-Т-клетки истощаются с помощью устройства магнитного разделения клинического класса. Клетки γδ культивируют совместно с искусственными антигенпрезентирующими клетками, полученными из K562, и расширяют.

Abstract

Хотя Т-клетки Vγ9Vδ2 являются незначительным подмножеством Т-лимфоцитов, эта популяция востребована за ее способность распознавать антигены основным комплексом гистосовместимости (MHC) независимым образом и развивать сильную цитолитическую эффекторную функцию, что делает ее идеальным кандидатом для иммунотерапии рака. Из-за низкой частоты гамма-дельта (γδ) Т-клеток в периферической крови мы разработали эффективный протокол для значительного расширения высокочистого лекарственного препарата γδ-клеток для первого в человеке использования аллогенных γδ Т-клеток у пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). Используя здоровый донорский аферез в качестве аллогенного источника клеток, лимфоциты выделяют с помощью валидированного устройства для метода противоточного центрифугирования разделения клеток по размеру и плотности.

Используется богатая лимфоцитами фракция, и γδ Т-клетки предпочтительно активируются золедроновой кислотой (одобренной FDA) и интерлейкином (IL)-2 в течение 7 дней. После предпочтительного расширения γδ Т-клеток для истощения загрязняющих Т-клеточных рецепторов (TCR)αβ Т-клеток используется магнитное устройство для разделения клеток клинического класса и шарики TCRαβ. Высокообогащенные γδ Т-клетки затем подвергаются второму расширению с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток (aAPC), полученных из клеток K562, генетически модифицированных для экспрессии одноцепочечного переменного фрагмента (scFv) для CD3 и CD28, 41BBL (CD137L) и IL15-RA-вместе с золедроновой кислотой и IL-2. Посев в течение всего дня 7 обогащенных γδ Т-клеток в кокультуре с aAPC облегчает производство высокочистых γδ Т-клеток со средним расширением в 229 000 раз > из здоровой донорской крови.

Introduction

Рецидив лейкемии является основной причиной смертности после трансплантации гемопоэтических клеток (HCT) у пациентов с ОМЛ1,2,3. Сообщалось о лучшей выживаемости без лейкемии при повышенном восстановлении γδ Т-клеток крови после HCT без повышенного риска болезни трансплантата против хозяина (GVHD)4. Способность γδ Т-клеток распознавать антигены независимым от MHC способом и развивать сильные цитолитические и Th1-подобные эффекторные функции делает эту незначительную субпопуляцию Т-клеток идеальной для лечения пациентов с ОМЛ, подвергающихся аллогенной трансплантации с риском рецидива5. Учитывая, что Т-клетки Vγ9Vδ2 являются второстепенным подмножеством Т-лимфоцитов в диапазоне от 0,5% до 5% Т-клеток на периферии6, мы решили создать надежную систему для расширения этой редкой популяции клеток крови для достижения потенциально терапевтических доз для клинических испытаний.

Хотя другие успешно расширили γδ Т-клетки, используя золедроновую кислоту и даже aAPC, мы разработали процесс, который потенциально может расширить γδ Т-клетки в 229 749 раз. Расширение двухфазное: сначала лимфоциты получают элютрированием с помощью инструмента разделения. Оборудование обеспечивает замкнутую систему, которая позволяет разделять ячейки на основе их размера, формы и плотности путем противоточного центрифугирования. После обогащения на лимфоциты селективное расширение Т-клеток Vγ9Vδ2 достигается лечением золедроновой кислотой и ИЛ-2 в течение 7 дней. Сразу после этого лечения TCR-αβ Т-клетки истощаются с использованием технологии микрогранул, что позволяет впоследствии расширять γδ Т-клетки с помощью APC, полученных из K562.

Для валидации процесса было использовано только 5 × 106 γδ-Т-клеток, расширенных золедроновой кислотой, для расширения кокультуры фазы-2 с aAPC. На этом втором этапе расширения γδ Т-клетки активируются с использованием текущего Банка рабочих клеток (WCB), совместимого с надлежащей производственной практикой (cGMP), генетически модифицированных APC K562 (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)), изготовленных в Моффитте. Обоснование этого двухфазного расширения основано на способности золедроновой кислоты ингибировать фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что приводит к накоплению изопентенилпирофосфата, который непосредственно стимулирует клетки Vγ2Vδ2. На второй фазе расширения производные от K562 aAPC (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) обеспечивают надежную стимуляцию всех Т-клеток. Тем не менее, клеточный продукт уже был обогащен для γδ Т-клеток, что привело к надежному расширению γδ Т-клеток.

С использованием специального оборудования и колб процесс представляет собой функционально закрытую систему, что снижает риск загрязнения. Кроме того, 1 л закрытого системного биореактора способствует максимальному росту и расширению клеток в общем объеме 1 л среды с минимальной потребностью в питании. Преимущество метода Моффитта заключается в том, что он обеспечивает быструю, воспроизводимую и высокоосуществимую систему GMP для получения высокочистого продукта γδ-Т-клеток донорского происхождения для аллогенного введения. Этот метод может быть применен к любому клиническому испытанию, которое направлено на использование человеческих γδ Т-клеток, экспрессирующих рецепторы Т-клеток Vγ2Vδ2, в качестве приемной иммунотерапии для опосредования иммунитета против микробов и опухолей у больных раком с частичной и полной ремиссией. Кроме того, он обеспечивает надежную платформу для разработки и производства γδ химерных антиген-рецептор-положительных (CAR+) Т-клеток.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Было получено одобрение IRB и получено информированное согласие от доноров. 1. Выделение лимфоцитов Перенесите продукт афереза в чистое помещение.ПРИМЕЧАНИЕ: Валидация процесса проводилась с использованием обычного донорского афереза от внешнего коммерческого поставщика, соответствующего правилам сбора клеточного сырья. Соберите образцы для тестирования на стерильность, количество клеток и фенотипирование клеток. Элютриат на устройстве центрифугирования противотока с использованием первичной среды сбалансированного раствора соли Хэнкса с 1% сывороточного альбумина человека (HSA) и вторичной среды физиологического раствора (0,9% хлорида натрия для инъекций USP) или фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS). Установите скорость центрифугирования элютриации на уровне 900 × g и соберите фракции на основе расхода и времени. Соберите образцы из фракции 2 и выполните следующие испытания: 2 мл для проверки на стерильность; 0,5 мл для количества и жизнеспособности клеток с использованием акридина оранжевого/йодида пропидия (АО/ПИ); 5 × 106 клеток для фенотипирования клеток методом проточной цитометрии. Расширить чистую фракцию лимфоцитов (фракция 2) клеток в культуре при 10 × 106 клеток/см2 в 1 л закрытого системного биореактора с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2. Инкубировать в течение семи дней в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. 2. Истощение альфа-бета(αβ)Т-клеток Собирайте клетки из колбы с закрытой системой 1 л. Стерильно приварите 1-литровый трансферный пакет к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте соответствующий фармацевтический насос для переноса клеток в трансферную упаковку. Берут следующие пробы: 10 мл на отработанную среднюю стерильность; 0,5 мл клеток для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5 × 106 клеток для проточной цитометрии Повторное суспендирование клеток при ~5 × 108 клеток/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) или (PBS/этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА)) буфере + 0,5% HSA и биотинилированное TCR αβ-специфическое антитело. Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием. Промывайте ячейки общим количеством 600 мл буфера PBS/EDTA + 0,5% HSA. Центрифуга удаляет несвязанное антитело при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °С. Повторное суспендирование ~5 × 108 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA с антибиотин-специфическими микрошариками (7,5 мл/1 флакон). Поместите шейкер в холодильник и высиживайте ячейки при 2-8 °C в течение приблизительно 15 мин с встряхиванием. После инкубации центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при 2-8 °C для удаления несвязанных микрошариков. Повторное суспендирование ~6 × 107 клеток/мл в буфере PBS/EDTA + 0,5% HSA и перенос их в сумку для переноски. Установите комплект трубок в устройство разделения магнитных клеток клинического класса, следуя инструкциям производителя, поместите упаковки с буфером PBS / EDTA и передаточным пакетом с клеточным продуктом в приборе и увеличьте его по указанию прибора. Выберите протокол Depletion 1.2 для истощения меченых αβ Т-клеток. Центрифугировать целевую фракцию (обогащенную γδ Т-клетками) и повторно суспендировать клетки в среде, дополненной 10% сывороткой AB человека. Возьмите образец объемом 0,5 мл и выполните подсчет и жизнеспособность клеток с окрашиванием AO / PI. Доведите клетки до конечной концентрации приблизительно 1 × 106 клеток/мл. Возьмите образец из 5 × 106 клеток продукта для фенотипирования проточной цитометрии после истощения. 3. Совместная культура с APC Облучение 5 × 107 aAPC/колба при 100 Гр на рентгеногенерирующем приборе. Используйте aAPC в кокультуре в соотношении 10:1 с γδ Т-клетками. Поместите облученные APC (5 × 107 клеток/колбу) и γδ Т-клетки (5 × 106 клеток/колбу) в колбы с закрытой системой 1 л закрытой системы с 1 л питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Высевают до 10 колб. Разверните клетки в культуре в течение 10 дней в инкубаторе при 37 °C и 5% CO2. Контролируйте уровень глюкозы и лактата каждые 3-4 дня с помощью полосок, глюкозы и лактатометра. Если уровень глюкозы падает до 250 мг/дл, уменьшите объем в колбе до 200 мл с помощью фармацевтического насоса путем стерильной сварки 1-литрового трансферного пакета к красной линии закрытого системного биореактора. Смешайте клетки в оставшихся 200 мл и возьмите образец 0,5 мл для подсчета клеток и измерения жизнеспособности путем окрашивания AO-PI. Если количество клеток составляет ≥109, разделите одну колбу на две колбы и заполните каждую колбу до 1 л AIM-V, дополненной 10% сывороткой AB человека. Если количество клеток составляет <109, кормите клетки свежим литром питательной среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Повторите шаг 3.6 для всех колб и верните их в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Повторяйте шаги 3,4-3,7 каждые 3-4 дня. 4. Сбор клеток По истечении 10 дней в кокультуре собирают все колбы биореактора. Соберите 1 колбу биореактора за раз и объедините все клетки в трансферную упаковку соответствующего размера. Стерильно приварите трансферную упаковку к красной линии биореактора с закрытой системой и используйте фармацевтический насос для переноса клеток в передаточный пакет. Удаляют следующие образцы контроля качества: 1% лекарственного препарата (ДП) для стерильности путем посева крови и окрашивания граммами; 0,5 мл для подсчета и жизнеспособности клеток с использованием АО/ПИ; 5-10 × 106 клеток для проточной цитометрии (см. Рисунок 1 для стратегии гастинга); 0,5 мл для эндотоксина; 0,5 мл для окрашивания в грамм; 106 клеток превратились в 10 мл отработанной среды для тестирования на микоплазму. Центрифугируют клетки при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре и выбрасывают супернатант. Промыть ячейки раствором сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA при 200-500 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторно суспендируют их в целевом объеме 100-300 мл сбалансированного кристаллоидного раствора + 0,5% HSA. 5. Тестирование релиза Провести контроль качества γδ Т-клеток DP для следующего: чистоты и идентичности методом проточной цитометрии (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); жизнеспособность при окрашивании АО/ПИ; эндотоксин; Тестирование микоплазмы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); стерильность путем окрашивания по граму и аэробных и анаэробных культур крови; остаточный анализ К562 методом проточной цитометрии (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

Процесс γδ Т-клеток был охарактеризован и оптимизирован для производства лекарственного препарата γδ Т-клеток. Оптимизация процесса включала 1) обогащение лимфоцитов с использованием элютриации, 2) γδ Т-клеточное лекарственное вещество (DS) клеточно-специфическое расширение золедроновой кислотой, 3) γδ T-клеточное разрушение DS TCRαβ, 4) вторичное расширение γδ T-клеточной DS с использованием K562-производных aAPC и 5) конечный сбор DP и рецептура продукта для введения или криоконсервации. После оптимизации процесса были выполнены подтверждающие прогоны в масштабе с использованием материала, полученного от трех здоровых доноров, для подтверждения пригодности обработки клеток. Все данные были проанализированы и обобщены в Таблице 1, Таблице 2 и Таблице 3. Клетки, отделенные от постпротивоточного центрифугирования фракции 2 (F2), дали чистую популяцию лимфоцитов со средним содержанием 99,23% клеток CD45+ (сообщается как частота общего живого затвора) и отличной средней жизнеспособностью 95,80% (таблица 1). γδ Т-клеточное специфическое расширение с золедроновой кислотой зависело от начального процента естественных клеток-киллеров (NK), присутствующих в фракции лимфоцитов (F2) после элютриации. Обогащение γδ Т-клеток DS с истощением TCRαβ было последовательным (таблица 2). Γδ T-клеточный DP, изготовленный из трех здоровых доноров, имел в среднем 0,11% ± 0,05% CD20 + В-клеток и 0,00% ± 0,00% TCR αβ + Т-клеток, таким образом, удовлетворяя критерию высвобождения ≤1% TCR αβ + Т-клеток. Средний процент NK-клеток в конечном продукте составляет 17,06% ± 26,19% и соответствует критерию высвобождения <35%. Кроме того, средний процент Т-клеток и NK-клеточных линейно-отрицательных клеток в конечном продукте составил 0,48% ± 0,42% (таблица 3). Окрашивание поверхности клеток и проточный цитометрический анализ использовались для характеристики идентичности, чистоты и технологических примесей DS и DP, как показано на рисунке 2A-D. Вторичное расширение, достигнутое из кокультуры aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB и γδ Т-клетки DS в соотношении 10:1, генерировало γδ T-ячейку DP, которая соответствовала всем критериям высвобождения, как показано в таблице 4. Кроме того, клетки окрашивали и оценивали с помощью проточной цитометрии на 0-й день центрифугирования клеток F2, Т-клеток, расширенных 7-золедроновой кислотой, истощения Т-клеток 7-TCR αβ, 17-го дня ДП для следующего кластера биомаркеров дифференцировки (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC хемокиновый рецептор 7 (CCR7), запрограммированный белок гибели клеток-1 (PD-1), цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4 (CTLA4), активирующий лимфоциты ген 3 (LAG3) и Т-клеточный иммуноглобулин и муцин, содержащий домен белка 3 (TIM3). Данные, показанные на рисунке 3 , усреднены из трех независимых прогонов и демонстрируют, что ячейки не достигли истощения. Moffitt CTF также разработал остаточный анализ K562 для определения примесей DP, связанных с APC, полученными из K562 (рисунок 4). Стратегия проточного цитометрического гатинга, используемая для характеристики процентного соотношения типов клеток, была следующей: 1) обнаружение Т- и NK клеточной линии отрицательной популяции (CD3-CD56-CD16-); 2) затвор на CD71+ (рецептор трансферрина, экспрессируемый в эритроидной линии и ОМЛ, позволяющий обнаруживать остаточные клетки K562). Эта стратегия измерения позволила оценить клетки CD3-CD16-CD56-CD71+, которые являются aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (называемый «остаточным K562» на рисунке 4). Эта система позволяет перечислить остаточный K562 в конечном DP путем умножения частоты остаточного K562 на общее количество жизнеспособных чисел (TVC) DP (71+ × DP TVC = Остаточные ячейки K562 в DP). Все цитометрические данные потока сообщаются как частота живых клеток. В таблице 5 и на рисунке 4 приведены процентные доли отрицательных по линии Т-клеток и NK-клеток, а также остаточных клеток K562. Для определения статистической значимости различий между этими популяциями был проведен двуххвостый т-тест, который показал, что существует значительная разница между WCB и γδ T-клетками DP и между WCB и γδ T-клетками (t = 0,0019 для Т-клеток и NK-клеток с отрицательной линией; t < 0,0001 для остаточного K562 и t = 0,0314 для Т-клеток и NK-клеток – отрицательный; t < 0,0001 для остаточного K562) (таблица 5). Рисунок 1: Схематическое представление стратегии проточной цитометрической решетки. Сокращения: aAPC = , искусственная антигенпрезентирующая клетка; SSC-A = площадь бокового рассеяния пика; FSC-A = прямая площадь рассеяния пика; SSC-H = высота бокового рассеяния пика; FSC-H = прямая высота рассеяния пика; CD = кластер дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Состав исходного материала, промежуточных продуктов и конечного лекарственного средства. Все показанные данные усредняются из трех независимых запусков. (A) Аферез от здоровых доноров подвергается элютрированию с использованием устройства центрифугирования противотока, в результате чего образуется F2 (богатая лимфоцитами фракция), которая используется в качестве исходного материала. (B) F2 подвергается Vγ9Vδ2 Т-клеточному расширению в течение 7 дней с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2 в 1 л среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. (C) Истощение TCR αβ Т-клеток осуществляется на продукте, вскрываемом золедроновой кислотой. (D) Высокочистый γδ Т-клеточный лекарственный препарат собирают после второго 10-дневного расширения облученными aAPC в соотношении 1:10 с 5 мкмоль/л золедроновой кислоты и 300 МЕ/мл IL-2 в 1 л среды, дополненной 10% сывороткой AB человека. Сокращения: NK = природный убийца; CD = кластер дифференциации; TCR = Т-клеточный рецептор; IL = интерлейкин; aAPC = искусственные антигенпрезентирующие клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Биомаркеры исходного материала, промежуточных продуктов и конечного лекарственного средства. Клетки собираются и окрашиваются для CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 и TIM3 в день 0-противоточного центрифугирования F2 клеток, 7-го дня золедроновой кислоты-расширенных Т-клеток, 7-TCR αβ Т-клеток дня, 17-го дня окончательного лекарственного препарата. Все показанные данные усредняются из трех независимых запусков. (A) Стволовые (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- и CCR7+), показанные как общее количество живых клеток. (B) Центральная память (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ и CCR7+), изображенная в процентах от CD3+ TCR γδ+ клеток. Сокращения: CD = кластер дифференциации; TCR = Т-клеточный рецептор; IL = интерлейкин; . CCR7 = CC хемокиновый рецептор 7; PD-1 = запрограммированный белок гибели клеток-1; CTLA4 = цитотоксический Т-лимфоцитарно-ассоциированный белок 4; LAG3 = ген, активирующий лимфоциты 3; TIM3 = Т-клеточный иммуноглобулин и муциновый домен-содержащий белок 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Репрезентативные данные остаточного анализа K562 (CD3-CD16-CD56-CD71+). Сокращения: aAPC = искусственная антигенпрезентирующая клетка; NK = естественная клетка-киллер; SSC-A = площадь бокового рассеяния пика; CD = кластер дифференциации; IL = интерлейкин; TCR = Т-клеточный рецептор; MCB = банк главных ячеек; FMO = флуоресценция минус единица; DP = лекарственное средство; WCB = банк рабочих ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Этапы процесса Параметры Доноров Средний Св. Выполнить 1 Выполнить 2 Вылет 3 Постобогащение (фракция лимфоцитов F2) TVC Все валидации процессов были посеяны на 109 TVC 1,00 Х 109 1,00 Х 109 1,00 Х 109 1,00 Х 109 0.00 Жизнеспособность (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 CD20+ В-клетки (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 CD3+ Т-клетка (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Таблица 1: Сводка об обогащении лимфоцитов элютрированием, сообщаемая как частота живых клеток. Сокращения: ТВЦ = общее число жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер. Этапы процесса Параметры Доноров Средний Св. Выполнить 1 Выполнить 2 Вылет 3 7-дневное расширение после золедроновой кислоты (до истощения TCRαβ) ТВЦ 3,69 Х 109 1,79 Х 109 1,42 Х 109 2,3 Х 109 1,22 Х 109 Жизнеспособность (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 CD20+ В-клетки 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 CD3+ Т-клетка (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Истощение после TCRαβ ТВЦ 1,81 х 109 4,95 Х 108 3,80 Х 108 8,95 х108 7,94 Х 108 Жизнеспособность клеток (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 CD20+ В-клетки 2.26 12 6.59 6.95 4.88 CD3+ Т-клетка (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 Отрицательная линия Т-клеток и NK-клеток (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ ТВЦ 0.00 4,95 х 103 3,8 Х 103 2,92 Х 103 2,59 Х 103 TCR γδ+ ТВЦ 1,73 Х 109 2,23 Х 108 3,39 Х 108 7,64 Х 108 8,39 Х 108 CD3-CD56+CD16+ NK ТВЦ 6,97 Х 107 2,97 Х 108 3.72Е+07 1,35 Х 108 1,42 Х 108 Таблица 2: Сводная информация о расширении γδ Т-клеток золедроновой кислотой и инструментальном обогащении, сообщаемом как частота живых клеток. Сокращения:TVC = общее количество жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер. Атрибуты продукта Параметры Доноров Средний Св. Выполнить 1 Выполнить 2 Вылет 3 День 0 γδ Т-клетки 2,48 Х 107 1,59 Х 107 2,10 Х 107 2,06 Х 107 4,47 Х 107 День 7 после обогащения γδ Т-клеток 1,73 Х 109 2,23 Х 108 3,39 Х 108 7,64 Х 108 8,39 Х 108 Свернутое расширение на 7-й день 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 ТВЦ при сборе урожая* 8,14 Х 1010 1,67 Х 1010 6,84 Х 1010 5,55 Х 1010 3,42 Х 1010 Жизнеспособность клеток (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 CD20+ В-клетки (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 CD3+ Т-клетка (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 CD3-CD56 + CD16 + NK-клетки (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 Отрицательные линии Т-клеток и NK-клеток, CD71+ Residual K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Общее количество γδ Т-клеток в Harvest 7,93 Х 1012 8,38 Х 1011 6,65 Х 1012 5,14 Х 1012 3,78 Х 1012 Полное сложение γδ Т-клеток (от дня 0 до сбора урожая) 3,20 Х 105 5,27 Х 104 3,17 Х 105 2,30 Х 105 1,53 Х 105 * Валидация процесса была уменьшена до колбы с 5 X 106 γδ Т-ячейкой и 50 X106 облученными aAPC. Приведенные цифры относятся к прогнозируемому полномасштабному запуску, если 24 колбы посеяны из использованного лекарственного вещества D7. Таблица 3: Сводка кокультуры γδ+ Т-клеток с aAPC и расширенного сбора γδ+ Т-клеток, сообщаемая как частота живых клеток. * Валидация процесса была уменьшена до одного биореактора с закрытой системой (емкость 1 л) с 5 × 106 γδ Т-клетками и 50 × 106 облученными aAPC. Сообщаемые цифры относятся к прогнозируемому полномасштабному запуску, если 24 колбы посеяны из лекарственного вещества D7. Сокращения: aAPCs = искусственные антигенпрезентирующие клетки; TVC = общее количество жизнеспособных; TCR = Т-клеточный рецептор; CD = кластер дифференциации; NK = естественная клетка-киллер. Параметр теста Критерии приемлемости Результаты Проверка 1 Проверка 2 Проверка 3 Жизнеспособность ≥ 70% 92.80% 85.50% 87.30% Микоплазмы Отрицательная Отрицательная Отрицательная Отрицательная Стерильность Финал без роста (14 дней) Финал без роста (14 дней) Финал без роста (14 дней) Финал без роста (14 дней) Граммовое пятно Организмы не замечены (NOS) НОС НОС НОС Эндотоксин ≤ 2 ЕС/мл <0.50 ЕС/мл <0.50 ЕС/мл <0.50 ЕС/мл Таблица 4: Резюме результатов испытаний на высвобождение γδ-Т-клеток для контроля качества. Остаточный анализ K562 К562 ВКБ Только γδ γδ + WCB Продукт T и NK клеточная линия нег. % Остаточный K562 % T и NK клеточная линия нег. % Остаточный K562 % T и NK клеточная линия нег. % Остаточный K562 % T и NK клеточная линия нег. % Остаточный K562 % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 Н/Д Н/Д 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д 98.7 98.3 98.6 97.6 Н/Д Н/Д Н/Д Н/Д Средний 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 Св. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Таблица 5: Т-клеточные и NK-клеточные линейные и остаточные K562 проценты, сообщаемые как частота живых клеток. Сокращения: NK = естественная клетка-киллер; WCB = банк рабочих ячеек.

Discussion

Лаборатория клеточной терапии Моффита разработала протокол с двухфазным расширением высокочистых γδ Т-клеток для использования в качестве DP в клинических испытаниях. Этот протокол обеспечивает метод производства в соответствии с руководящими принципами cGMP в закрытой системе, которая дает высокочистую γδ T-ячейку DP, которая успешно активируется и расширяется золедроновой кислотой и WCB aAPCs. Этот протокол был одобрен FDA для производства аллогенной γδ Т-клеточной DP для пациентов с ОМЛ. Используя здоровых доноров, мы успешно расширили небольшую популяцию донорских γδ Т-клеток всего за 7 дней с 2,06 ± 0,45% до 54,45 ± 28,34%. После 7-дневного расширения золедроновой кислотой было замечено, что донор 2 имел увеличение популяции НК.

Золедроновая кислота ингибирует фарнезилдифосфатсинтазу (FDPS) в моноцитах, что, в свою очередь, приводит к накоплению изопентенилпирофосфата (IPP), что коррелирует со значительным увеличением пролиферации Т-клеток и естественных NK-клеток7,8,9. Это увеличение популяции NK препятствует 2-й фазе расширения с aAPCs, поскольку aAPC будут только способствовать дальнейшему расширению NK-клеток. По этой причине критерии доноров были изменены, чтобы исключить доноров с высокой численностью населения Нагорного Карабаха. После истощения αβ Т-клеток γδ Т-клетки были дополнительно обогащены до 76,61 ± 27,51%. Этот уникальный протокол включает в себя второе расширение, использующее APC производства Моффита для нацеливания на рецепторы CD8, CD28 и CD127L в γδ Т-клетках. Эта вторая фаза расширения с aAPC дала DP с ≥65% для CD3 + TCR γδ + Т-клеток, ≤1% TCRαβ T и <35% CD3-CD16 + CD56 + NK-клеток. В связи с использованием APC, полученных из K562, было необходимо продемонстрировать, что эти APC составляют <1% конечного продукта.

Moffit CTF разработал проточный цитометрический анализ, используемый для критериев высвобождения для измерения процента остаточных клеток K562 в конечном DP. Этот проточный цитометрический анализ смягчает все проблемы использования антигенов клеточной поверхности для идентификации клеток K562. Поскольку активированные Т-клетки могут экспрессировать CD71, мы разработали стратегию исключения всех Т-клеток и NK-клеток путем выделения популяций CD3-CD56- и CD16– , а затем изучения клеток CD71+ , которые будут исключительно клетками K562. Этот протокол демонстрирует, что DP γδ Т-клеток дает 0,48 ± 0,42% остаточных клеток K562 и соответствует всем критериям высвобождения жизнеспособности ≥70%, негативности микоплазмы с помощью ПЦР, отсутствия организмов, видимых при окрашивании граммами, ≤2 ЕС / мл эндотоксина и отсутствия стерильности конечного роста (14 дней) культуры крови.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим премию «Клеточная иммунотерапия-исследователь инициировал испытания» от Онкологического центра Моффитта за финансирование этого протокола. Мы также благодарим д-ра Клаудио Анасетти за его неоценимую помощь и руководство в рамках этого проекта. Наконец, мы благодарим д-ра Джастина Буше за его идеи и рецензию на рукопись.

Materials

Hanks Balanced Salt Solution R&D 285-GMP
Human Albumin 25% Grifolis 65483-16-071
Plasmalyte A Fisher 2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa) Hos pira 4215-04–8 FDA approved drug
DMSO WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH WAK-DMSO-10
CS10 BIOLIFE SOLUTIONS 210374
3 mL syringe BD 309657
10 mL syringe BD 309604
20 mL syringe BD 302830
50 mL syringe BD 309653
100 mL syringe JMS 992861
18g Needle Fisher 305198
Cryovials 1.8 mL Fisher 375418
5 mL pipette Fisher 1367811D
50 mL pipette Fisher 1367610Q
10 mL pipette Fisher 1367811E
100 mL pipette Fisher 07-200-620
15 mL conical Fisher 05-539-12
50 mL conical Fisher 05-539-7
250 mL conical Fisher 430776
600 mL Transfer Pack TERUMO BCT INC 1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES 03-220-90
Elutra Tubing Set TerumoBCT 70800
100 MCS GREX WILSON WOLF MFG CORP 81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system Fisher Scientific 22-246660
Acacia Pump boot MPS Medical In 17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer Miltenyi Biotec Inc 130-070-525
Dornase Alpha Genentech, Inc 50242-100-40/186-0055 FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter Fisher 157-0020
Blood Filter 170um B.Braun V2500
CliniMACs Tubing set Miltenyi Biotec Inc 130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit Miltenyi Biotec Inc 130-021-301
Y-Type blood set Fenwal FWL4C2498H
75 mL Flask Fisher 430641U
IL-2 Prometheus 65483-116-071 FDA approved drug
AIM-V Fisher 0870112BK
Human AB serum Gemini Bio-Product 100H41T
3 Liter Transfer pack Independent Medical Associates T3109
1000  pipette tips Fisher Scientific 5991040
CF-250 KOLBio CF-250
Elutra TERUMOBCT
CliniMACS Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator Thermo Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
  2. Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
  3. Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
  4. Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
  5. Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
  6. Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
  7. Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
  8. Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
  9. Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).

Tags

Gamma-delta T CellsCytotoxic ActivityCancerAcute Myeloid LeukemiaExpansionEnrichmentApheresisCell TherapyElutriationCell CultureBioreactorZoledronic AcidIL-2Flow Cytometry

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Landin, A. M., Cox, C., Yu, B., Bejanyan, N., Davila, M., Kelley, L. Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (γδ) T Cells from Apheresed Human Product. J. Vis. Exp. (175), e62622, doi:10.3791/62622 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image