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Cancer Research

Erweiterung und Anreicherung von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen aus Apheresed Human Product

Published: September 22, 2021
doi:
10.3791/62622
, , , , ,
1Cell Therapy Facility,Moffitt Cancer Center and Research Institute, 2Department of Immunology,Moffitt Cancer Center and Research Institute

Summary

Vorgestellt wird ein Protokoll für die Expansion von Gamma-Delta (γδ) T-Zell-Arzneimittel. Lymphozyten werden durch Elutriation isoliert und γδ-angereichert mit Zoledronsäure und Interleukin-2. Alpha-Beta-T-Zellen werden mit einem magnetischen Trenngerät in klinischer Qualität erschöpft. Die γδ-Zellen werden mit K562-abgeleiteten, künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen ko-kultiviert und expandiert.

Abstract

Obwohl Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten sind, ist diese Population wegen ihrer Fähigkeit gefragt, Antigene in einer MHC-unabhängigen Weise zu erkennen und eine starke zytolytische Effektorfunktion zu entwickeln, die sie zu einem idealen Kandidaten für die Krebsimmuntherapie macht. Aufgrund der geringen Häufigkeit von Gamma-Delta (γδ) T-Zellen im peripheren Blut haben wir ein effektives Protokoll entwickelt, um ein hochreines γδ-T-Zell-Arzneimittel für die erstmalige Verwendung von allogenen γδ-T-Zellen bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) stark zu erweitern. Unter Verwendung einer gesunden Spenderapherese als allogene Zellquelle werden die Lymphozyten mit einem validierten Gerät für eine Gegenstromzentrifugationsmethode zur Trennung von Zellen nach Größe und Dichte isoliert.

Die lymphozytenreiche Fraktion wird genutzt, und die γδ T-Zellen werden bevorzugt mit Zoledronsäure (FDA-zugelassen) und Interleukin (IL)-2 für 7 Tage aktiviert. Nach der bevorzugten Expansion von γδ-T-Zellen werden ein magnetisches Zelltrennvorrichtung klinischer Qualität und TCRαβ-Kügelchen verwendet, um kontaminierende T-Zell-Rezeptor-(TCR)αβ-T-Zellen zu depletieren. Die hochangereicherten γδ-T-Zellen durchlaufen dann eine zweite Expansion unter Verwendung von künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs), die aus K562-Zellen abgeleitet sind – gentechnisch verändert, um ein einkettiges variables Fragment (scFv) für CD3 und CD28, 41BBL (CD137L) und IL15-RA zusammen mit Zoledronsäure und IL-2 zu exprimieren. Die Aussaat aller day-7 angereicherten γδ T-Zellen in Kokultur mit den aAPCs erleichtert die Herstellung hochreiner γδ T-Zellen mit einer durchschnittlichen Faltenausdehnung von >229.000-fach aus gesundem Spenderblut.

Introduction

Leukämierezidigung ist die häufigste Todesursache nach hämatopoetischer Zelltransplantation (HCT) bei Patienten mit AML1,2,3. Ein besseres leukämiefreies Überleben wurde mit der erhöhten Erholung von Blut-γδ-T-Zellen nach HCT ohne erhöhtes Risiko für eine Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD)4 berichtet. Die Fähigkeit von γδ-T-Zellen, Antigene MHC-unabhängig zu erkennen und starke zytolytische und Th1-ähnliche Effektorfunktionen zu entwickeln, macht diese kleine Subpopulation von T-Zellen ideal für die Behandlung von AML-Patienten, die sich einer allogenen Transplantation mit Rückfallrisiko unterziehen5. Angesichts der Tatsache, dass die Vγ9Vδ2-T-Zellen eine untergeordnete Untergruppe von T-Lymphozyten im Bereich von 0,5% bis 5% der T-Zellen in der Peripherie6 sind, haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein robustes System zur Erweiterung dieser seltenen Population von Blutzellen zu etablieren, um potenziell therapeutische Dosen für klinische Studien zu erreichen.

Obwohl andere erfolgreich γδ T-Zellen mit Zoledronsäure und sogar aAPCs erweitert haben, haben wir ein Verfahren entwickelt, das γδ T-Zellen potenziell um das 229.749-fache erweitern kann. Die Expansion ist biphasisch: Zuerst werden Lymphozyten durch Elutriation mit dem Trenninstrument gewonnen. Die Ausrüstung bietet ein geschlossenes System, das die Trennung von Zellen basierend auf ihrer Größe, Form und Dichte durch Gegenstromzentrifugation ermöglicht. Nach der Anreicherung für Lymphozyten wird die selektive Expansion von Vγ9Vδ2 T-Zellen durch Behandlung mit Zoledronsäure und IL-2 für 7 Tage erreicht. Unmittelbar nach dieser Behandlung werden TCR-αβ T-Zellen mit Hilfe der Mikrokügelchentechnologie depletiert, was eine anschließende Erweiterung der γδ-T-Zellen mit K562-abgeleiteten aAPCs ermöglicht.

Für die Prozessvalidierung wurden nur 5 × 106 Zoledronsäure-expandierte γδ T-Zellen für die Phase-2-Cokulturexpansion mit aAPCs verwendet. In dieser zweiten Expansionsphase werden γδ-T-Zellen unter Verwendung einer aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP)-konformen Working Cell Bank (WCB) aus gentechnisch veränderten K562-abgeleiteten AAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) aktiviert, die bei Moffitt hergestellt werden. Die Begründung für diese biphasische Expansion basiert auf der Fähigkeit von Zoledronsäure, die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten zu hemmen, was zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat führt, das die Vγ2Vδ2-Zellen direkt stimuliert. In der zweiten Expansionsphase bieten die von K562 abgeleiteten aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) eine robuste Stimulation für alle T-Zellen. Das Zellprodukt wurde jedoch bereits für die γδ-T-Zellen angereichert, was zu einer robusten Expansion der γδ-T-Zellen führt.

Durch die Verwendung von speziellen Geräten und Kolben ist das Verfahren ein funktional geschlossenes System, wodurch das Risiko einer Kontamination verringert wird. Darüber hinaus ermöglicht der 1-l-Bioreaktor mit geschlossenem System ein maximales Wachstum und eine maximale Ausdehnung der Zellen in einem Gesamtvolumen von 1 L Medium mit minimalem Fütterungsbedarf. Der Vorteil der Moffitt-Methode besteht darin, dass sie ein schnelles, reproduzierbares und sehr praktikables GMP-System zur Herstellung eines hochreinen, aus dem Spender gewonnenen γδ-T-Zellprodukts für die allogene Verabreichung bietet. Diese Methode kann auf jede klinische Studie angewendet werden, die darauf abzielt, menschliche γδ T-Zellen, die Vγ2Vδ2-T-Zellrezeptoren exprimieren, als adoptive Immuntherapie zu verwenden, um immunität gegen Mikroben und Tumore bei Krebspatienten mit partieller und vollständiger Remission zu vermitteln. Darüber hinaus bietet es eine robuste Plattform für die Entwicklung und Produktion von γδ-chimären Antigenrezeptor-positiven (CAR+) T-Zellen.

Protocol

HINWEIS: Die IRB-Genehmigung wurde eingeholt, und die Einwilligung der Spender nach Aufklärung wurde eingeholt. 1. Lymphozytenisolierung Das Aphereseprodukt in einen Reinraum überführen.HINWEIS: Die Prozessvalidierung wurde unter Verwendung der normalen Spenderapherese von einem externen kommerziellen Anbieter durchgeführt, der den Vorschriften für die Sammlung von Rohzellstoffen entspricht. Sammeln Sie Proben für Sterilitätstests, Zellzahl und Zellphänotypisierung. Elutriat auf der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung unter Verwendung eines primären Mediums von Hanks Balanced Salt Solution mit 1% humanem Serumalbumin (HSA) und einem sekundären Medium Kochsalzlösung (0,9% Natriumchlorid Injektions-USP) oder Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Stellen Sie die Elutriationszentrifugationsgeschwindigkeit auf 900 × g ein und sammeln Sie Fraktionen basierend auf Durchflussrate und Zeit. Sammeln Sie Proben von Fraktion 2 und führen Sie die folgenden Tests durch: 2 ml für die Sterilitätsprüfung; 0,5 ml für Zellzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von Acridinorange/Propidiumiodid (AO/PI); 5 × 106 Zellen für die Zellphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie. Expansion einer reinen Lymphozytenfraktion (Fraktion 2) von Zellen in Kultur bei 10 × 106 Zellen/cm2 in einem 1 L Geschlossensystem-Bioreaktor mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2. Sieben Tage lang in einem bei 37 °C eingestellten Inkubator mit 5% CO2 inkubieren. 2. Alpha-Beta (αβ) T-Zell-Depletion Ernte von Zellen aus dem 1 L-Bioreaktorkolben mit geschlossenem System. Schweißen Sie ein 1-Liter-Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors mit geschlossenem System und verwenden Sie die entsprechende pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen. Nehmen Sie die folgenden Proben: 10 ml für verbrauchte mittlere Sterilität; 0,5 ml Zellen für Zellanzahl und Lebensfähigkeit unter Verwendung von AO / PI; 5 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie Resuspendieren Sie die Zellen bei ~5 × 108 Zellen/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder (PBS/Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) Puffer + 0,5% HSA und biotinyliertem TCR αβ-spezifischem Antikörper. Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit insgesamt 600 ml PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA. Zentrifuge zur Entfernung des ungebundenen Antikörpers bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 Zellen/ml im PBS/EDTA-Puffer + 0,5% HSA mit Anti-Biotin-spezifischen Mikrokügelchen (7,5 ml/1 Durchstechflasche). Den Shaker in den Kühlschrank stellen und die Zellen bei 2-8 °C ca. 15 min unter Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation werden die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei 2-8 °C zentrifugiert, um die ungebundenen Mikrokügelchen zu entfernen. Resuspend ~ 6 × 107 Zellen / ml in PBS / EDTA-Puffer + 0,5% HSA und übertragen Sie sie in einen Transferpackbeutel. Installieren Sie den Schlauchsatz in der magnetischen Zelltrennvorrichtung in klinischer Qualität, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen, legen Sie die Packungen mit dem PBS / EDTA-Puffer und das Transferpaket mit dem Zellprodukt in das Instrument und spitzen Sie es auf Anweisung des Geräts. Wählen Sie das Depletion 1.2-Protokoll für die Depletion der markierten αβ T-Zellen aus. Zentrifugieren Sie die Zielfraktion (angereicherte γδ T-Zellen) und resuspenieren Sie die Zellen in Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Nehmen Sie eine 0,5 ml Probe und führen Sie eine Zellzahl und Lebensfähigkeit mit AO / PI-Färbung durch. Bringen Sie die Zellen auf eine Endkonzentration von etwa 1 × 106 Zellen / ml. Nehmen Sie eine Probe von 5 × 106 Zellen des Produkts für die Durchflusszytometrie-Phänotypisierung nach der Depletion. 3. Co-Kultur mit aAPCs Bestrahlung von 5 × 107 aAPCs/Kolben bei 100 Gy auf das Röntgengerät. Verwenden Sie die aAPCs in Co-Kultur im Verhältnis 10:1 mit den γδ T-Zellen. Die bestrahlten aAPCs (5 × 107 Zellen/Kolben) und γδ T-Zellen (5 × 106 Zellen/Kolben) werden in 1 L-Bioreaktorflaschen mit 1 L Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, gegeben. Samen Sie bis zu 10 Kolben. Die Zellen in Kultur für 10 Tage in einem Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 ausdehnen. Überwachen Sie den Glukose- und Laktatspiegel alle 3-4 Tage mit Streifen, Glukose und einem Laktatmessgerät. Wenn die Glukose auf 250 mg/dl sinkt, wird das Volumen im Kolben mit einer pharmazeutischen Pumpe auf 200 ml reduziert, indem eine 1-Liter-Transferpackung zur roten Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems steril geschweißt wird. Mischen Sie die Zellen in den verbleibenden 200 ml und nehmen Sie eine 0,5 ml Probe für die Zellzählung und Lebensfähigkeitsmessung durch AO-PI-Färbung. Wenn die Zellzahl ≥109 beträgt, teilen Sie einen Kolben in zwei Kolben auf und füllen Sie jeden Kolben bis zu 1 l mit AIM-V, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wenn die Zellzahl <109 beträgt, füttern Sie die Zellen mit einem frischen Liter Kulturmedium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. Wiederholen Sie Schritt 3.6 für alle Kolben und bringen Sie sie bei 37 °C und 5 % CO2 in den Inkubator zurück. Wiederholen Sie die Schritte 3.4-3.7 alle 3 bis 4 Tage. 4. Zellernte Am Ende von 10 Tagen in Co-Kultur alle Bioreaktorkolben ernten. Ernten Sie jeweils 1 Bioreaktorkolben und fassen Sie alle Zellen in einer Transferpackung von geeigneter Größe zusammen. Schweißen Sie das Transferpaket steril an die rote Linie des Bioreaktors des geschlossenen Systems und verwenden Sie die pharmazeutische Pumpe, um die Zellen in das Transferpaket zu übertragen. Entfernen Sie die folgenden Qualitätskontrollproben: 1% des Arzneimittels (DP) für die Sterilität durch Blutkultur und Grammfärbung; 0,5 ml für Zellzählung und Lebensfähigkeit mit AO/PI; 5-10 × 106 Zellen für die Durchflusszytometrie (siehe Abbildung 1 zur Gating-Strategie); 0,5 ml für Endotoxin; 0,5 ml für gramm Färben; 106 Zellen wurden für Mykoplasmentests auf 10 ml verbrauchtes Medium aufgespießt. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand. Waschen Sie die Zellen in einer Lösung aus ausgewogener kristalloider Lösung + 0,5% HSA bei 200-500 × g für 15 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie sie in einem Zielvolumen von 100-300 ml balancierter kristalloider Lösung + 0,5% HSA. 5. Release-Tests Durchführung von Qualitätskontrolltests der γδ-T-Zelle DP auf Folgendes: Reinheit und Identität durch Durchflusszytometrie (Lebend/Tot, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); Lebensfähigkeit durch AO/PI-Färbung; Endotoxin; Mykoplasmentest durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR); Sterilität durch Grammfärbung und aerobe und anaerobe Blutkulturen; Rest-K562-Assay mittels Durchflusszytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

Der γδ-T-Zell-Prozess wurde für die Herstellung des γδ-T-Zell-Wirkstoffprodukts charakterisiert und optimiert. Die Prozessoptimierung umfasste 1) Lymphozytenanreicherung mittels Elutriation, 2) γδ-T-Zell-Wirkstoffsubstanz (DS) zellspezifische Expansion mit Zoledronsäure, 3) γδ T-Zell-DS-Depletion von TCRαβ, 4) sekundäre Expansion der γδ-T-Zell-DS unter Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs und 5) endgültige DP-Ernte und Formulierung des Produkts zur Verabreichung oder Kryokonservierung. Nach der Prozessoptimierung wurden Bestätigungsläufe in großem Maßstab unter Verwendung des von drei gesunden Spendern gewonnenen Materials durchgeführt, um die Eignung der Zellverarbeitung zu bestätigen. Alle Daten wurden analysiert und sind in Tabelle 1, Tabelle 2 und Tabelle 3 zusammengefasst. Die von der Post-Counterflow-Zentrifugationsfraktion 2 (F2) getrennten Zellen ergaben eine reine Lymphozytenpopulation mit durchschnittlich 99,23% CD45+ -Zellen (berichtet als Häufigkeit des gesamten Live-Gates) und einer ausgezeichneten durchschnittlichen Lebensfähigkeit von 95,80% (Tabelle 1). Die γδ-T-Zell-spezifische Expansion mit Zoledronsäure hing vom Anfangsprozentsatz der natürlichen Killerzellen (NK) ab, die nach der Elutriation in der Lymphozytenfraktion (F2) vorhanden waren. Die Anreicherung von γδ-T-Zell-DS mit TCRαβ-Depletion war konsistent (Tabelle 2). Die aus drei gesunden Spendern hergestellte γδ-T-Zell-DP hatte durchschnittlich 0,11% ± 0,05% CD20+ B-Zellen und 0,00% ± 0,00% TCR αβ+ T-Zellen und erfüllte damit das Freisetzungskriterium von ≤1% der TCR αβ+ T-Zellen. Der durchschnittliche Prozentsatz der NK-Zellen im Endprodukt beträgt 17,06% ± 26,19% und erfüllt das Freisetzungskriterium von <35%. Darüber hinaus betrug der durchschnittliche Prozentsatz der T-Zell- und NK-Zelllinien-negativen Zellen im Endprodukt 0,48% ± 0,42% (Tabelle 3). Zelloberflächenfärbung und durchflusszytometrische Analyse wurden verwendet, um die Identität, Reinheit und Prozessverunreinigungen von DS und DP zu charakterisieren, wie in Abbildung 2A-D gezeigt. Die sekundäre Expansion, die durch die Kokultur der aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB und γδ T Zell DS im Verhältnis 10:1 erreicht wurde, erzeugte eine γδ T-Zell-DP, die alle Freisetzungskriterien erfüllte, wie in Tabelle 4 gezeigt. Darüber hinaus wurden die Zellen gefärbt und mittels Durchflusszytometrie an Tag 0-Gegenstromzentrifugation F2-Zellen, Tag 7-Zoledronsäure-expandierte T-Zellen, Tag 7-TCR αβ T-Zell-Depletion, Tag 17-final DP für die folgenden Biomarker Cluster der Differenzierung (CD) 3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC Chemokinrezeptor 7 (CCR7), programmiertes Zelltodprotein-1 (PD-1), zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4 (CTLA4), Lymphozyten-aktivierendes Gen 3 (LAG3) und T-Zell-Immunglobulin und Mucin-Domänen-haltiges Protein 3 (TIM3). Die in Abbildung 3 gezeigten Daten werden aus drei unabhängigen Durchläufen gemittelt und zeigen, dass die Zellen die Erschöpfung noch nicht erreicht haben. Das Moffitt CTF entwickelte auch einen Rest-K562-Assay, um die DP-Verunreinigungen im Zusammenhang mit den von K562 abgeleiteten aAPCs zu bestimmen (Abbildung 4). Die durchflusszytometrische Gating-Strategie, die zur Charakterisierung der Prozentsätze der Zelltypen verwendet wurde, war wie folgt: 1) Gating auf T- und NK-Zelllinien-negativer Population (CD3-CD56-CD16-); 2) Gate auf CD71+ (Transferrinrezeptor exprimiert in erythroider Abstammung und AML ermöglicht den Nachweis von K562-Restzellen). Diese Gating-Strategie ermöglichte die Auswertung der CD3-CD16-CD56-CD71+-Zellen, bei denen es sich um die aAPC(K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (in Abbildung 4 als “Residual K562” bezeichnet) handelt. Dieses Gating ermöglicht die Zählung des Residuums K562 im endgültigen DP, indem die Frequenz des Residuums K562 mit der Gesamtlebenszahl (TVC) der DP multipliziert wird (71+ × DP TVC = Residual K562 Zellen in der DP). Alle durchflusszytometrischen Daten werden als Häufigkeit lebender Zellen angegeben. Tabelle 5 und Abbildung 4 enthalten die Prozentsätze von T-Zell- und NK-Zelllinien-negativen sowie verbleibenden K562-Zellen. Ein zweiseitiger t-Test wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen diesen Populationen zu bestimmen und zeigte, dass es einen signifikanten Unterschied zwischen WCB- und γδ-T-Zellen DP und zwischen WCB- und γδ-T-Zellen gab (t = 0,0019 für T-Zell- und NK-Zelllinie-negativ; t < 0,0001 für Residual K562 und t = 0,0314 für T-Zell- und NK-Zelllinie negativ; t < 0,0001 für Residual K562) (Tabelle 5). Abbildung 1: Schematische Darstellung der durchflusszytometrischen Gating-Strategie. Abkürzungen: aAPC = , künstliche Antigen-präsentierende Zelle; SSC-A = seitliche Streufläche des Peaks; FSC-A = Vorwärtsstreufläche des Peaks; SSC-H = seitliche Streuhöhe des Peaks; FSC-H = Vorwärtsstreuhöhe des Peaks; CD = Cluster der Differenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Zusammensetzung des Ausgangsmaterials, der Zwischenprodukte und des Endprodukts. Alle angezeigten Daten werden aus drei unabhängigen Durchläufen gemittelt. (A) Die Apherese von gesunden Spendern wird mit der Gegenstromzentrifugationsvorrichtung elutriiert, was zu F2 (lymphozytenreiche Fraktion) führt, die als Ausgangsmaterial verwendet wird. (B) F2 durchläuft 7 Tage lang eine Vγ9Vδ2-T-zellspezifische Expansion mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2 in 1 L Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum. (C) TCR αβ T-Zell-Depletion wird an dem Zoledronsäure-expandierten Produkt durchgeführt. (D) Ein hochreines γδ-T-Zell-Arzneimittel wird nach einer zweiten 10-tägigen Expansion mit bestrahlten aAPCs im Verhältnis 1:10 mit 5 μmol/L Zoledronsäure und 300 I.E./ml IL-2 in 1 l Medium, ergänzt mit 10% humanem AB-Serum, geerntet. Abkürzungen: NK = natural killer; CD = Cluster der Differenzierung; TCR= T-Zell-Rezeptor; IL = Interleukin; aAPCs = künstliche Antigen-präsentierende Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Biomarker des Ausgangsmaterials, der Zwischenprodukte und des Endprodukts. Die Zellen werden gesammelt und gefärbt für CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 und TIM3 am Tag 0-Gegenstromzentrifugations-F2-Zellen, Tag 7-Zoledronsäure-expandierte T-Zellen, Tag 7-TCR αβ T-Zell-Depletion, Tag 17-Endarzneimittel. Alle angezeigten Daten werden aus drei unabhängigen Durchläufen gemittelt. (A) Stammartig (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO- und CCR7+) als Gesamtzahl der lebenden Zellen dargestellt. (B) Zentralspeicher (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ und CCR7+) dargestellt als Prozentsatz der CD3+ TCR γδ+ Zellen. Abkürzungen: CD = Cluster der Differenzierung; TCR= T-Zell-Rezeptor; IL = Interleukin; . CCR7 = CC-Chemokinrezeptor 7; PD-1 = programmiertes Zelltodprotein-1; CTLA4 = zytotoxisches T-Lymphozyten-assoziiertes Protein 4; LAG3 = Lymphozyten-aktivierendes Gen 3; TIM3 = T-Zell-Immunglobulin und Mucin-Domänen-haltiges Protein 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Repräsentative Daten eines K562-Residualassays (CD3-CD16-CD56-CD71+). Abkürzungen: aAPC = künstliche Antigen-präsentierende Zelle; NK = natürliche Killerzelle; SSC-A = seitliche Streufläche des Peaks; CD = Cluster der Differenzierung; IL = Interleukin; TCR = T-Zell-Rezeptor; MCB = Master-Zellbank ; FMO = Fluoreszenz minus eins; DP = Arzneimittel; WCB = working cell bank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Prozessschritte Parameter Geldgeber Durchschnitt St. Dev. Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Post-Enrichment (Lymphozytenfraktion F2) TVC Alle Prozessvalidierungen wurden auf 109 TVC gesetzt 1,00 x 109 1,00 x 109 1,00 x 109 1,00 x 109 0.00 Lebensfähigkeit (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 CD20+ B-Zellen (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 CD3+ T-Zelle (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 CD3-CD56+CD16+ NK Zellen (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 T-Zell- und NK-Zelllinie negativ (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tabelle 1: Zusammenfassung der Lymphozytenanreicherung durch Elutriation, die als Häufigkeit lebender Zellen angegeben wird. Abkürzungen: TVC = total viable count; TCR = T-Zell-Rezeptor; CD = Cluster der Differenzierung; NK = natürliche Killerzelle. Prozessschritte Parameter Geldgeber Durchschnitt St. Dev. Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 7-tägige Post-Zoledronsäure-Expansion (prä-TCRαβ-Depletion) TVC 3,69 x 109 1,79 x 109 1,42 x 109 2,3 x 109 1,22 x 109 Lebensfähigkeit (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 CD20+ B Zellen 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 CD3+ T-Zelle (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 CD3-CD56+CD16+ NK Zellen (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 T-Zell- und NK-Zelllinie negativ (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Post-TCRαβ-Depletion TVC 1,81 x 109 4,95 x 108 3,80 x 108 8,95 x 108 7,94 x 108 Zelllebensfähigkeit (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 CD20+ B Zellen 2.26 12 6.59 6.95 4.88 CD3+ T-Zelle (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 CD3-CD56+CD16+ NK Zellen (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 T-Zell- und NK-Zelllinie negativ (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4,95 x 103 3,8 x 103 2,92 x 103 2,59 x 103 TCR γδ+ TVC 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 x 108 7,64 x 108 8,39 x 108 CD3-CD56+ CD16+ NK TVC 6,97 x 107 2,97 x 108 3.72E+07 1,35 x 108 1,42 x 108 Tabelle 2: Zusammenfassung der γδ-T-Zellexpansion mit Zoledronsäure und Der Instrumentenanreicherung, die als Häufigkeit lebender Zellen angegeben wird. Abkürzungen:TVC = total viable count; TCR = T-Zell-Rezeptor; CD = Cluster der Differenzierung; NK = natürliche Killerzelle. Produktattribute Parameter Geldgeber Durchschnitt St. Dev. Lauf 1 Lauf 2 Lauf 3 Tag 0 γδ T Zellen 2,48 x 107 1,59 x 107 2,10 x 107 2,06 x 107 4,47 x 107 Tag 7 nach der Anreicherung γδ T Zellen 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 x 108 7,64 x 108 8,39 x 108 FaltenErweiterung an Tag 7 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC bei der Ernte* 8,14 x 1010 1,67 x 1010 6,84 x 1010 5,55 x 1010 3,42 x 1010 Zelllebensfähigkeit (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 CD20+ B-Zellen (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 CD3+ T-Zelle (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 CD3-CD56+CD16+ NK Zellen (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 T-Zell- und NK-Zelllinie negativ, CD71+ Residual K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 γδ T-Zellen insgesamt bei Harvest 7,93 x 1012 8,38 x 1011 6,65 x 1012 5,14 x 1012 3,78 x 1012 Total Fold Expansion von γδ T Zellen (Von Tag 0 bis Ernte) 3,20 x 105 5,27 x 104 3,17 x 105 2,30 x 105 1,53 x 105 *Die Prozessvalidierung wurde auf einen Kolben mit 5 X 106 γδ T-Zelle und 50 X106 bestrahlten aAPCs herunterskaliert. Die gemeldeten Zahlen beziehen sich auf einen projizierten Gesamtlauf, wenn 24 Kolben aus der D7-Wirkstoffsubstanz ausgesät wurden. Tabelle 3: Zusammenfassung der γδ+ T-Zell-Kokultur mit aAPCs und der erweiterten γδ+ T-Zellernte, die als Häufigkeit lebender Zellen gemeldet wurde. *Die Prozessvalidierung wurde auf einen Geschlossensystem-Bioreaktor (1 L Kapazität) mit 5 × 106 γδ T-Zellen und 50 × 106 bestrahlten aAPCs herunterskaliert. Die gemeldeten Zahlen beziehen sich auf einen projizierten Gesamtlauf, wenn 24 Kolben aus der D7-Arzneimittelsubstanz ausgesät werden. Abkürzungen: aAPCs = künstliche Antigen-präsentierende Zellen; TVC = Gesamtzahl der lebensfähigen Zähler; TCR = T-Zell-Rezeptor; CD = Cluster der Differenzierung; NK = natürliche Killerzelle. Testparameter Akzeptanzkriterien Befund Validierung 1 Validierung 2 Validierung 3 Lebensfähigkeit ≥ 70% 92.80% 85.50% 87.30% Mykoplasmen Negativ Negativ Negativ Negativ Sterilität No Growth Final (14 Tage) No Growth Final (14 Tage) No Growth Final (14 Tage) No Growth Final (14 Tage) Gramm-Färbung Keine Organismen gesehen (NOS) NOS NOS NOS Endotoxin ≤ 2 EU/ml <0,50 EU/ml <0,50 EU/ml <0,50 EU/ml Tabelle 4: Zusammenfassung der Ergebnisse der Qualitätskontroll-Freisetzungstests für die γδ-T-Zellen. Rest-K562-Assay K562 WCB Nur γδ γδ + WCB Produkt T- und NK-Zelllinie neg. % Rest K562 % T- und NK-Zelllinie neg. % Rest K562 % T- und NK-Zelllinie neg. % Rest K562 % T- und NK-Zelllinie neg. % Rest K562 % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 N/A N/A 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 N/A N/A N/A N/A 98.7 98.3 98.6 97.6 N/A N/A N/A N/A Durchschnitt 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 St. Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tabelle 5: T-Zell- und NK-Zelllinien-negative und residuale K562-Prozentsätze, die als Häufigkeit lebender Zellen angegeben wurden. Abkürzungen: NK = natürliche Killerzelle; WCB = working cell bank.

Discussion

Das Moffit Cell Therapy Lab hat ein Protokoll mit einer biphasischen Expansion von hochreinen γδ T-Zellen für den Einsatz als DP in klinischen Studien entwickelt. Dieses Protokoll bietet eine Herstellungsmethode nach cGMP-Richtlinien in einem geschlossenen System, die eine hochreine γδ-T-Zell-DP ergibt, die erfolgreich durch Zoledronsäure und die WCB-aAPCs aktiviert und expandiert wird. Dieses Protokoll wurde von der FDA für die Herstellung eines allogenen γδ-T-Zell-DP für AML-Patienten zugelassen. Mit gesunden Spendern konnten wir die kleine Population von Spender-γδ-T-Zellen in nur 7 Tagen von 2,06 ± 0,45% auf 54,45 ± 28,34% erweitern. Nach der 7-tägigen Expansion mit Zoledronsäure wurde beobachtet, dass Spender 2 eine Zunahme der NK-Population aufwies.

Zoledronsäure hemmt die Farnesyldiphosphat-Synthase (FDPS) in Monozyten, was wiederum zur Akkumulation von Isopentenylpyrophosphat (IPP) führt, was mit einer signifikanten Zunahme der Proliferation von T-Zellen und natürlichen NK-Zellen korreliert wurde7,8,9. Diese erhöhte NK-Population behindert die 2. Expansionsphase mit den aAPCs, da die aAPCs nur zur weiteren Expansion der NK-Zellen beitragen werden. Aus diesem Grund wurden die Spenderkriterien modifiziert, um Spender mit hohen NK-Populationen auszuschließen. Nach Erschöpfung der αβ-T-Zellen wurden die γδ-T-Zellen weiter auf 76,61 ± 27,51% angereichert. Dieses einzigartige Protokoll umfasst eine zweite Erweiterung unter Verwendung der von Moffit hergestellten aAPCs, um auf die CD8-, CD28- und CD127L-Rezeptoren in den γδ-T-Zellen abzuzielen. Diese zweite Expansionsphase mit den aAPCs ergab einen DP mit ≥65% für CD3+TCR γδ+ T Zellen, ≤1% TCRαβ T und <35% CD3-CD16+CD56+ NK Zellen. Aufgrund der Verwendung von K562-abgeleiteten aAPCs musste nachgewiesen werden, dass diese aAPCs <1% des Endprodukts ausmachten.

Das Moffit CTF entwickelte einen durchflusszytometrischen Assay, der für die Freisetzungskriterien verwendet wird, um den Prozentsatz der verbleibenden K562-Zellen in der endgültigen DP zu messen. Dieser durchflusszytometrische Assay mildert alle Probleme bei der Verwendung von Zelloberflächenantigenen zur Identifizierung der K562-Zellen. Da aktivierte T-Zellen CD71 exprimieren können, entwickelten wir eine Strategie, um alle T-Zellen und NK-Zellen auszuschließen, indem wir auf CD3-CD56– und CD16-Populationen gating und dann die CD71+ Zellen untersuchten, die ausschließlich K562-Zellen wären. Dieses Protokoll zeigt, dass die γδ-T-Zell-DP 0,48 ± 0,42% der verbleibenden K562-Zellen liefert und alle Freisetzungskriterien von ≥70% Lebensfähigkeit, Mykoplasmen-Negativität durch PCR, keine Organismen, die durch Grammfärbung gesehen werden, ≤2 EU / ml Endotoxin und keine endgültige (14 Tage) Blutkultursterilität erfüllt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity des Moffitt Cancer Center für die Bereitstellung der Finanzierung dieser Protokollentwicklung. Wir danken auch Dr. Claudio Anasetti für seine unschätzbare Hilfe und Anleitung durch dieses Projekt. Abschließend danken wir Dr. Justin Boucher für seine Einsichten und die Überprüfung des Manuskripts.

Materials

Hanks Balanced Salt Solution R&D 285-GMP
Human Albumin 25% Grifolis 65483-16-071
Plasmalyte A Fisher 2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa) Hos pira 4215-04–8 FDA approved drug
DMSO WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH WAK-DMSO-10
CS10 BIOLIFE SOLUTIONS 210374
3 mL syringe BD 309657
10 mL syringe BD 309604
20 mL syringe BD 302830
50 mL syringe BD 309653
100 mL syringe JMS 992861
18g Needle Fisher 305198
Cryovials 1.8 mL Fisher 375418
5 mL pipette Fisher 1367811D
50 mL pipette Fisher 1367610Q
10 mL pipette Fisher 1367811E
100 mL pipette Fisher 07-200-620
15 mL conical Fisher 05-539-12
50 mL conical Fisher 05-539-7
250 mL conical Fisher 430776
600 mL Transfer Pack TERUMO BCT INC 1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES 03-220-90
Elutra Tubing Set TerumoBCT 70800
100 MCS GREX WILSON WOLF MFG CORP 81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system Fisher Scientific 22-246660
Acacia Pump boot MPS Medical In 17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer Miltenyi Biotec Inc 130-070-525
Dornase Alpha Genentech, Inc 50242-100-40/186-0055 FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter Fisher 157-0020
Blood Filter 170um B.Braun V2500
CliniMACs Tubing set Miltenyi Biotec Inc 130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit Miltenyi Biotec Inc 130-021-301
Y-Type blood set Fenwal FWL4C2498H
75 mL Flask Fisher 430641U
IL-2 Prometheus 65483-116-071 FDA approved drug
AIM-V Fisher 0870112BK
Human AB serum Gemini Bio-Product 100H41T
3 Liter Transfer pack Independent Medical Associates T3109
1000  pipette tips Fisher Scientific 5991040
CF-250 KOLBio CF-250
Elutra TERUMOBCT
CliniMACS Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator Thermo Scientific
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References

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Gamma-delta T CellsCytotoxic ActivityCancerAcute Myeloid LeukemiaExpansionEnrichmentApheresisCell TherapyElutriationCell CultureBioreactorZoledronic AcidIL-2Flow Cytometry

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Landin, A. M., Cox, C., Yu, B., Bejanyan, N., Davila, M., Kelley, L. Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (γδ) T Cells from Apheresed Human Product. J. Vis. Exp. (175), e62622, doi:10.3791/62622 (2021).
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