المقدمة هو بروتوكول لتوسيع غاما دلتا (γδ) تي منتج المخدرات الخلية. يتم عزل الخلايا الليمفاوية عن طريق التملؤ وتخصيب γδ مع حمض الزوليدرونيك وبينلوكين-2. يتم استنفاد خلايا ألفا بيتا تي باستخدام جهاز فصل مغناطيسي من الدرجة السريرية. يتم استزراع الخلايا مع خلايا تقديم مستضد اصطناعية مشتقة من K562 وتوسيعها.
على الرغم من أن Vγ9Vδ2 T الخلايا هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T, وسعى بعد هذه المجموعة لقدرتها على التعرف على المستضدات في مجمع التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) بطريقة مستقلة وتطوير وظيفة قوية التأثير الخلوي الذي يجعلها مرشحا مثاليا للعلاج المناعي للسرطان. نظرا لانخفاض وتيرة غاما دلتا (γδ) الخلايا التائية في الدم المحيطي، وضعنا بروتوكول فعال لتوسيع كبير في نقية للغاية γδ الخلايا التائية المنتج المخدرات للاستخدام الأول في الإنسان من الخلايا التائية الالوجينية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). باستخدام التخسيس المانح السليم كمصدر للخلايا المسببة للسرطان ، يتم عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام جهاز تم التحقق من صحته لطريقة الطرد المركزي للتدفق المضاد لفصل الخلايا حسب الحجم والكثافة.
يستخدم الكسر الغني بالخلايا اللمفاوية ، ويتم تنشيط الخلايا التائية بشكل تفضيلي مع حمض الزوليدرونيك (وافقت عليه FDA) وinterleukin (IL) – 2 لمدة 7 أيام. بعد التوسع التفضيلي للخلايا التائية γδ، يتم استخدام جهاز فصل الخلايا المغناطيسية من الدرجة السريرية والخرز TCRαβ لاستنفاد مستقبلات الخلايا التائية الملوثة (TCR)αβ T cells. ثم تخضع الخلايا التائية عالية الإثراء لتوسع ثان باستخدام خلايا عرض مستضد اصطناعية هندسية (aAPCs) مشتقة من خلايا K562 المعدلة وراثيا للتعبير عن جزء متغير أحادي السلسلة (scFv) ل CD3 و CD28 و 41BBL (CD137L) و IL15-RA جنبا إلى جنب مع حمض الزولدروك وIL-2. البذر كل يوم-7 المخصب γδ الخلايا التائية في الثقافة المشتركة مع aAPCs يسهل تصنيع الخلايا التائية نقية للغاية مع متوسط توسيع أضعاف >229,000 أضعاف من الدم المتبرع صحية.
الانتكاس سرطان الدم هو السبب الرئيسي للوفيات بعد زرع الخلايا الدموية (HCT) في المرضى الذين يعانون من AML1,2,3. تم الإبلاغ عن بقاء أفضل خالية من سرطان الدم مع زيادة انتعاش خلايا الدم T γδ بعد HCT دون زيادة خطر الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف (GVHD)4. قدرة الخلايا التائية γδ على التعرف على المستضدات بطريقة مستقلة MHC وتطوير وظائف قوية المتحللة الخلوية وTh1 مثل تأثير جعل هذا السكان الفرعية طفيفة من الخلايا التائية مثالية لعلاج المرضى الذين يخضعون لعملية زرع الخلايا الالوجينية في خطر الانتكاس5. وبالنظر إلى أن الخلايا التائية Vγ9Vδ2 هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T تتراوح بين 0.5٪ إلى 5٪ من الخلايا التائية في المحيط6، شرعنا في إنشاء نظام قوي لتوسيع هذه المجموعة النادرة من خلايا الدم لتحقيق جرعات علاجية محتملة للتجارب السريرية.
على الرغم من أن البعض الآخر قد توسعت بنجاح γδ الخلايا التائية باستخدام حمض الزوليدروك وحتى aAPCs, لقد وضعنا عملية يمكن أن توسع يحتمل أن γδ الخلايا التائية من قبل 229,749 أضعاف. التوسع ثنائي الطور: أولا ، يتم الحصول على الخلايا الليمفاوية عن طريق التملص باستخدام أداة الفصل. توفر المعدات نظاما مغلقا يسمح بفصل الخلايا استنادا إلى حجمها وشكلها وكثافتها عن طريق الطرد المركزي للتدفق المضاد. بعد إثراء للخلايا الليمفاوية، يتم تحقيق التوسع الانتقائي للخلايا T Vγ9Vδ2 عن طريق العلاج مع حمض الزوليدرونيك وIL-2 لمدة 7 أيام. بعد هذا العلاج مباشرة، يتم استنفاد الخلايا TCR-αβ باستخدام تكنولوجيا الميكروبات، مما يسمح للتوسع اللاحق للخلايا T γδ مع AAPCs المشتقة من K562.
للتحقق من صحة العملية، تم استخدام 5 × 106 خلايا تي موسعة حمض الزوليدرونيك فقط لتوسيع المرحلة-2 الثقافة المشتركة مع aAPCs. في هذه المرحلة الثانية من التوسع، يتم تنشيط الخلايا التائية باستخدام بنك خلايا العمل المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) (WCB) من AAPCs المشتقة من K562 المعدلة وراثيا (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) المصنعة في موفيت. ويستند الأساس المنطقي لهذا التوسع ثنائي الطور على قدرة حمض الزوليدرونيك على تثبيط فارنيسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في الخلايا الأحادية، مما يؤدي إلى تراكم الفوسفات البروفاسي الإيزوبينيل، الذي يحفز مباشرة خلايا Vγ2Vδ2. في المرحلة الثانية من التوسع، توفر المركبات المشتقة من K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) تحفيزا قويا لجميع الخلايا التائية. ومع ذلك، تم بالفعل إثراء منتج الخلية للخلايا التائية γδ، مما أدى إلى توسع قوي في الخلايا التائية γδ.
مع استخدام معدات وقوارير محددة ، فإن العملية هي نظام مغلق وظيفيا ، وبالتالي تقليل خطر التلوث. بالإضافة إلى ذلك، يسهل المفاعل الحيوي المغلق 1 لتر النمو الأقصى وتوسيع الخلايا في حجم إجمالي قدره 1 لتر من المتوسط مع الحد الأدنى من الحاجة للتغذية. ميزة طريقة موفيت هو أنه يوفر نظام خلية T سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للاستنساخ وممكنة للغاية لإنتاج نقية للغاية، مشتقة من المانح γδ منتج الخلية التائية للإدارة allogeneic. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي تجربة سريرية تهدف إلى استخدام الخلايا التائية البشرية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا T Vγ2Vδ2 كتناعي بالتبني للتوسط في المناعة ضد الميكروبات والأورام في مرضى السرطان الذين يعانون من مغفرة جزئية وكاملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر منصة قوية لتطوير وإنتاج γδ مستقبلات مستضد الشيمي إيجابية (CAR +) الخلايا التائية.
وقد وضعت مختبر Moffit العلاج بالخلايا بروتوكول مع التوسع ثنائي الطور من الخلايا التائية نقية للغاية لاستخدامها ك DP في التجارب السريرية. يوفر هذا البروتوكول طريقة تصنيع تحت المبادئ التوجيهية cGMP في نظام مغلق ينتج خلية T نقية للغاية DP التي يتم تنشيطها وتوسيعها بنجاح بواسطة حمض الزوليدروك وAPCs WCB. وقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل ادارة الاغذية والعقاقير لتصنيع خلية γδ T allogeneic DP لمرضى مكافحة غسل الأموال. باستخدام المتبرعين الأصحاء، قمنا بنجاح بتوسيع عدد السكان الصغير من الخلايا التائية المانحة في 7 أيام فقط من 2.06 ± 0.45٪ إلى 54.45 ± 28.34٪. بعد التوسع لمدة 7 أيام مع حمض الزوليدرونيك ، لوحظ أن المانح 2 كان لديه زيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ.
حمض الزوليدرونيك يمنع فارنسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في monocytes، والذي، بدوره، يؤدي إلى تراكم الفوسفات ثنائي فوسفات الإيزوبينيل (IPP)، والتي ارتبطت مع زيادة كبيرة في انتشار الخلايا التائية والخلايا الطبيعية NK7،8،9. هذه الزيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ تعيق المرحلة الثانية من التوسع مع AAPCs ، لأن AAPCs لن تسهم إلا في زيادة توسيع خلايا ناغورني كاراباخ. ولهذا السبب، عدلت معايير المانحين لاستبعاد المانحين الذين ترتفع أعدادهم في ناغورني كاراباخ. بعد استنفاد الخلايا التائية αβ، تم إثراء الخلايا التائية إلى 76.61 ± 27.51٪. يتضمن هذا البروتوكول الفريد توسعا ثانيا باستخدام مستقبلات Moffit المصنعة لاستهداف مستقبلات CD8 و CD28 و CD127L في الخلايا التائية. هذه المرحلة التوسع الثاني مع aAPCs أسفرت عن DP مع ≥65٪ للخلايا CD3 + TCR γδ + T، ≤1٪ TCRαβ، وخلايا CD3-CD16 + CD56 + NK <35٪. ونظرا لاستخدام مركبات الكربون الهيدروفلورية المشتقة من K562، كان من الضروري إثبات أن هذه المركبات تشكل <1 في المائة من المنتج النهائي.
طور Moffit CTF فحصا للتدفق الخلوي يستخدم لمعايير الإطلاق لقياس النسبة المئوية لخلايا K562 المتبقية في DP النهائي. هذا المقايسة الخلوية التدفق يخفف من جميع القضايا من استخدام مستضدات سطح الخلية لتحديد خلايا K562. كما تنشيط الخلايا التائية يمكن التعبير عن CD71، وضعنا استراتيجية لاستبعاد جميع الخلايا التائية وخلايا NK عن طريق gating على CD3– CD56– و CD16– السكان ومن ثم فحص خلايا CD71+ ، والتي ستكون حصرا خلايا K562. هذا البروتوكول يدل على أن οδ T الخلية DP تسفر عن 0.48 ± 0.42٪ من الخلايا K562 المتبقية ويلبي جميع معايير الإفراج عن ≥70٪ الجدوى، سلبية الميكوبلازما من قبل PCR، لا الكائنات الحية التي ينظر إليها من قبل تلطيخ غرام، ≤2 الاتحاد الأوروبي / مل من endotoxin، وليس نهائي النمو (14 يوما) عقم ثقافة الدم.
The authors have nothing to disclose.
نقدم الشكر للعلاجات المناعية الخلوية – المحقق بدء التجارب جائزة فرصة التمويل داخل العين من مركز موفيت للسرطان لتوفير التمويل لهذا التطور البروتوكول. كما نشكر الدكتور كلاوديو أنسيتي على مساعدته وتوجيهاته القيمة من خلال هذا المشروع. وأخيرا، نشكر الدكتور جاستن باوتشر على أفكاره ومراجعة المخطوطة.
Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04–8 | FDA approved drug |
DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
20 mL syringe | BD | 302830 | |
50 mL syringe | BD | 309653 | |
100 mL syringe | JMS | 992861 | |
18g Needle | Fisher | 305198 | |
Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
250 mL conical | Fisher | 430776 | |
600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
Elutra | TERUMOBCT | ||
CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |