Summary

Uitbreiding en verrijking van gamma-delta (γδ) T-cellen uit ontfereend menselijk product

Published: September 22, 2021
doi:

Summary

Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.

Abstract

Hoewel Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, is deze populatie gewild vanwege zijn vermogen om antigenen op een belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) -onafhankelijke manier te herkennen en een sterke cytolytische effectorfunctie te ontwikkelen die het een ideale kandidaat maakt voor kankerimmunotherapie. Vanwege de lage frequentie van Gamma-Delta (γδ) T-cellen in het perifere bloed, ontwikkelden we een effectief protocol om een zeer zuiver γδ T-cellengeneesmiddel sterk uit te breiden voor het eerste gebruik van allogene γδ T-cellen bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Met behulp van gezonde donoraferese als allogene celbron worden de lymfocyten geïsoleerd met behulp van een gevalideerd apparaat voor een tegenstroomcentrifugatiemethode om cellen te scheiden op grootte en dichtheid.

De lymfocytenrijke fractie wordt gebruikt en de γδ T-cellen worden bij voorkeur geactiveerd met zoledroninezuur (FDA-goedgekeurd) en interleukine (IL) -2 gedurende 7 dagen. Na de preferentiële expansie van γδ T-cellen worden een magnetisch celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit en TCRαβ-kralen gebruikt om contaminerende T-celreceptor (TCR)αβ T-cellen uit te putten. De sterk verrijkte γδ T-cellen ondergaan vervolgens een tweede expansie met behulp van gemanipuleerde kunstmatige antigeen-presenterende cellen (aAPCs) afgeleid van K562-cellen – genetisch gemanipuleerd om single-chain variabel fragment (scFv) tot expressie te brengen voor CD3 en CD28, 41BBL (CD137L) en IL15-RA- samen met zoledroninezuur en IL-2. Het zaaien van alle dag-7 verrijkte γδ T-cellen in co-kweek met de aAPCs vergemakkelijkt de vervaardiging van zeer zuivere γδ T-cellen met een gemiddelde vouwuitbreiding van >229.000-voudig uit gezond donorbloed.

Introduction

Leukemie-terugval is de belangrijkste doodsoorzaak na hematopoëtische celtransplantatie (HCT) bij patiënten met AML1,2,3. Betere leukemievrije overleving werd gemeld met het verhoogde herstel van bloed γδ T-cellen na HCT zonder verhoogd risico op Graft-versus-Host Disease (GVHD)4. Het vermogen van γδ T-cellen om antigenen op een MHC-onafhankelijke manier te herkennen en sterke cytolytische en Th1-achtige effectorfuncties te ontwikkelen, maakt deze kleine subpopulatie van T-cellen ideaal voor de behandeling van AML-patiënten die een allogene transplantatie ondergaan met een risico op terugval5. Aangezien de Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, variërend van 0,5% tot 5% van de T-cellen in de periferie6, wilden we een robuust systeem opzetten om deze zeldzame populatie van bloedcellen uit te breiden om potentieel therapeutische doses voor klinische onderzoeken te bereiken.

Hoewel anderen met succes γδ T-cellen hebben uitgebreid met behulp van zoledroninezuur en zelfs AAPCs, hebben we een proces ontwikkeld dat mogelijk γδ T-cellen met 229.749-voudig kan uitbreiden. De expansie is bifasisch: eerst worden lymfocyten verkregen door elutriatie met behulp van het scheidingsinstrument. De apparatuur biedt een gesloten systeem dat de scheiding van cellen mogelijk maakt op basis van hun grootte, vorm en dichtheid door tegenstroomcentrifugatie. Na verrijking voor lymfocyten wordt selectieve expansie van Vγ9Vδ2 T-cellen bereikt door behandeling met zoledroninezuur en IL-2 gedurende 7 dagen. Onmiddellijk na deze behandeling worden TCR-αβ T-cellen uitgeput met behulp van microbead-technologie, waardoor de γδ T-cellen vervolgens kunnen worden uitgebreid met K562-afgeleide aAPCs.

Voor procesvalidatie werden slechts 5 × 106 zoledroninezuur-geëxpandeerde γδ T-cellen gebruikt voor de fase-2 co-cultuur expansie met aAPCs. In deze tweede fase van uitbreiding worden γδ T-cellen geactiveerd met behulp van een huidige Good Manufacturing Practices (cGMP)-conforme Working Cell Bank (WCB) van genetisch gemanipuleerde K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) vervaardigd in Moffitt. De redenering van deze bifasische expansie is gebaseerd op het vermogen van zoledroninezuur om farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten te remmen, wat leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat, dat de Vγ2Vδ2-cellen direct stimuleert. In de tweede fase van expansie bieden de K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) een robuuste stimulatie aan alle T-cellen. Het celproduct is echter al verrijkt voor de γδ T-cellen, wat resulteert in een robuuste expansie van de γδ T-cellen.

Met behulp van specifieke apparatuur en kolven is het proces een functioneel gesloten systeem, waardoor het risico op besmetting wordt verminderd. Bovendien vergemakkelijkt de 1 L bioreactor met gesloten systeem maximale groei en expansie van cellen in een totaal volume van 1 L medium met minimale behoefte aan voeding. Het voordeel van de Moffitt-methode is dat het een snel, reproduceerbaar en zeer haalbaar GMP-systeem biedt om een zeer zuiver, van donor afgeleid γδ T-celproduct te produceren voor allogene toediening. Deze methode kan worden toegepast op elke klinische studie die gericht is op het gebruik van menselijke γδ T-cellen die Vγ2Vδ2 T-celreceptoren tot expressie brengen als adoptieve immunotherapie om immuniteit tegen microben en tumoren te bemiddelen bij kankerpatiënten met gedeeltelijke en volledige remissie. Daarnaast biedt het een robuust platform voor de ontwikkeling en productie van γδ chimere antigeenreceptorpositieve (CAR+) T-cellen.

Protocol

OPMERKING: IRB-goedkeuring werd verkregen en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de donoren. 1. Lymfocytenisolatie Breng het afereseproduct over naar een cleanroom.OPMERKING: Procesvalidatie werd uitgevoerd met behulp van normale donoraferese van een externe commerciële leverancier die voldoet aan de voorschriften voor het verzamelen van grondstoffen. Verzamel monsters voor steriliteitstests, celgetal en celfenotypering. Elutriate op het tegenstroomcentrifugatieapparaat met behulp van een primair medium hanks gebalanceerde zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine (HSA) en een secundair medium zoutoplossing (0,9% natriumchloride-injectie USP) of Dulbecco’s fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS). Stel de elutriatiecentrifugatiesnelheid in op 900 × g en verzamel fracties op basis van stroomsnelheid en tijd. Verzamel monsters van fractie 2 en voer de volgende tests uit: 2 ml voor steriliteitstests; 0,5 ml voor celgetal en levensvatbaarheid met behulp van acridine oranje/propidiumjodide (AO/PI); 5 × 106 cellen voor celfenotypering door flowcytometrie. Breid een zuivere lymfocytenfractie (fractie 2) van cellen uit in cultuur bij 10 × 106 cellen/cm2 in een bioreactor met gesloten systeem van 1 L met 5 μmol/L zoledroninezuur en 300 IE/ml IL-2. Incubeer gedurende zeven dagen in een incubator op 37 °C met 5% CO2. 2. Alfa-bèta (αβ) T-celdepletie Oogst cellen uit de 1 L bioreactorkolf met gesloten systeem. Las een transferpakket van 1 L steriel op de rode lijn van de bioreactor met gesloten systeem en gebruik de juiste farmaceutische pomp om de cellen in het transferpakket over te brengen. Neem de volgende monsters: 10 ml voor gebruikte medium steriliteit; 0,5 ml cellen voor celgetal en levensvatbaarheid met behulp van AO / PI; 5 × 106 cellen voor flowcytometrie Resuspend de cellen bij ~5 × 108 cellen/ml in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) of (PBS/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)) buffer + 0,5% HSA en gebiotinyleerd TCR αβ-specifiek antilichaam. Plaats de shaker in de koelkast en incubeer de cellen bij 2-8 °C gedurende ongeveer 15 minuten met schudden. Was de cellen met in totaal 600 ml PBS/EDTA-buffer + 0,5% HSA. Centrifugeer om het ongebonden antilichaam te verwijderen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij 2-8 °C. Resuspend ~ 5 × 108 cellen / ml in PBS / EDTA-buffer + 0,5% HSA met anti-biotine-specifieke microbeads (7,5 ml / 1 injectieflacon). Plaats de shaker in de koelkast en incubeer de cellen bij 2-8 °C gedurende ongeveer 15 minuten met schudden. Centrifugeer na incubatie de cellen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij 2-8 °C om de ongebonden microbeads te verwijderen. Resuspend ~ 6 × 107 cellen / ml in PBS / EDTA-buffer + 0,5% HSA en breng ze over naar een transferverpakkingszak. Installeer de slangenset in het magnetische celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit door de instructies van de fabrikant te volgen, plaats de verpakkingen met de PBS/EDTA-buffer en de transferverpakking met het celproduct in het instrument en spike deze wanneer het instrument u dit opdraagt. Selecteer het Depletion 1.2-protocol voor de depletie van de gelabelde αβ T-cellen. Centrifugeer de doelfractie (verrijkte γδ T-cellen) en resuspend de cellen in medium aangevuld met 10% humaan AB-serum. Neem een monster van 0,5 ml en voer een celtelling en levensvatbaarheid uit met AO / PI-kleuring. Breng cellen tot een eindconcentratie van ongeveer 1 × 106 cellen/ml. Neem een monster van 5 × 106 cellen van het product voor flowcytometrie fenotypering na depletie. 3. Co-cultuur met aAPCs Bestraal 5 × 107 aAPCs/kolf met 100 Gy op het röntgengenererende instrument. Gebruik de aAPCs in co-cultuur in een verhouding van 10:1 met de γδ T-cellen. Breng de doorstraalde aAPCs (5 × 107 cellen/kolf) en γδ T-cellen (5 × 106 cellen/kolf) in 1 L bioreactorkolven met gesloten systeem met 1 L kweekmedium aangevuld met 10% humaan AB-serum. Zaai tot 10 kolven. Zet de cellen in cultuur gedurende 10 dagen uit in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Controleer glucose- en lactaatspiegels elke 3-4 dagen met behulp van strips, glucose en een lactaatmeter. Als de glucose daalt tot 250 mg/dl, verlaagt u het volume in de kolf tot 200 ml met behulp van een farmaceutische pomp door een transferpakket van 1 L steriel te lassen aan de rode lijn van de bioreactor van het gesloten systeem. Meng de cellen in de resterende 200 ml en neem een monster van 0,5 ml voor celtelling en levensvatbaarheidsmeting door AO-PI-kleuring. Als het celgetal ≥109 is, splitst u één kolf in twee kolven en vult u elke kolf tot 1 l met AIM-V aangevuld met 10% humaan AB-serum. Als het celgetal <109 is, voedt u de cellen met een verse liter kweekmedium aangevuld met 10% humaan AB-serum. Herhaal stap 3.6 voor alle kolven en breng ze terug naar de couveuse bij 37 °C en 5% CO2. Herhaal stap 3.4-3.7 elke 3 tot 4 dagen. 4. Celoogst Aan het einde van 10 dagen in co-cultuur, oogst alle bioreactorkolven. Oogst 1 bioreactorkolf tegelijk en bundel alle cellen in een transferverpakking van de juiste grootte. Las het transferpakket steriel op de rode lijn van de bioreactor met gesloten systeem en gebruik de farmaceutische pomp om de cellen in het transferpakket over te brengen. Verwijder de volgende kwaliteitscontrolemonsters: 1% van het geneesmiddel (DP) voor steriliteit door bloedkweek en gramkleuring; 0,5 ml voor celtelling en levensvatbaarheid met behulp van AO/PI; 5-10 × 106 cellen voor flowcytometrie (zie figuur 1 voor gatingstrategie); 0,5 ml voor endotoxine; 0,5 ml voor gramkleuring; 106 cellen piekten in 10 ml verbruikt medium voor Mycoplasma-testen. Centrifugeer de cellen bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant weg. Was de cellen in een oplossing van gebalanceerde kristalloïde oplossing + 0,5% HSA bij 200-500 × g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend ze in een doelvolume van 100-300 ml gebalanceerde kristalloïde oplossing + 0,5% HSA. 5. Vrijgeven testen Uitvoeren van kwaliteitscontroletests van de γδ T-cel DP voor het volgende: zuiverheid en identiteit door flowcytometrie (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); levensvatbaarheid door AO/PI-kleuring; endotoxine; Mycoplasma testen door polymerasekettingreactie (PCR); steriliteit door gramkleuring en aerobe en anaërobe bloedculturen; residuele K562-test door flowcytometrie (CD3-CD16-CD56-CD71+).

Representative Results

Het γδ T-celproces werd gekarakteriseerd en geoptimaliseerd voor de productie van het γδ T-celgeneesmiddelproduct. Procesoptimalisatie omvatte 1) lymfocytenverrijking met behulp van elutriatie, 2) γδ T-celgeneesmiddelsubstantie (DS) celspecifieke expansie met zoledroninezuur, 3) γδ T-cel DS-depletie van TCRαβ, 4) secundaire expansie van de γδ T-cel DS met behulp van K562-afgeleide aAPCs, en 5) uiteindelijke DP-oogst en formulering van product voor toediening of cryopreservatie. Na procesoptimalisatie werden bevestigingsruns op schaal uitgevoerd met behulp van het materiaal dat is afgeleid van drie gezonde donoren om de geschiktheid voor celverwerking te bevestigen. Alle gegevens zijn geanalyseerd en samengevat in tabel 1, tabel 2 en tabel 3. De cellen gescheiden van de post-counterflow centrifugatiefractie 2 (F2) leverden een zuivere lymfocytenpopulatie op met een gemiddelde van 99,23% CD45+ cellen (gerapporteerd als de frequentie van de totale live gate) en een uitstekende gemiddelde levensvatbaarheid van 95,80% (tabel 1). De γδ T-celspecifieke expansie met zoledroninezuur was afhankelijk van het initiële percentage natural killer (NK) cellen aanwezig in de lymfocytenfractie (F2) na elutriëring. De verrijking van γδ T-cel DS met TCRαβ-depletie was consistent (tabel 2). De γδ T-cel DP vervaardigd van drie gezonde donoren had gemiddeld 0,11% ± 0,05% CD20+ B-cellen en 0,00% ± 0,00% TCR αβ+ T-cellen, waarmee werd voldaan aan het afgiftecriterium van ≤1% van de TCR αβ+ T-cellen. Het gemiddelde percentage NK-cellen in het eindproduct is 17,06% ± 26,19% en voldoet aan het afgiftecriterium van <35%. Bovendien was het gemiddelde percentage T-cel- en NK-cellijnnegatieve cellen in het eindproduct 0,48% ± 0,42% (tabel 3). Celoppervlakkleuring en flowcytometrische analyse werden gebruikt om de identiteit, zuiverheid en procesonzuiverheden van de DS en DP te karakteriseren, zoals weergegeven in figuur 2A-D. De secundaire expansie, verkregen uit de co-cultuur van de aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB en γδ T cel DS in een verhouding van 10:1, genereerde een γδ T cel DP die voldeed aan alle afgiftecriteria, zoals weergegeven in tabel 4. Bovendien werden de cellen gekleurd en beoordeeld door flowcytometrie op dag 0-tegenstroomcentrifugatie F2-cellen, dag 7-zoledroninezuur-geëxpandeerde T-cellen, dag 7-TCR αβ T-celdepletie, dag 17-definitieve DP voor de volgende biomarkerscluster van differentiatie (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC chemokinereceptor 7 (CCR7), geprogrammeerd celdoodeiwit-1 (PD-1), cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4 (CTLA4), lymfocyten-activerend gen 3 (LAG3) en T-cel immunoglobuline en mucinedomeinbevattend eiwit 3 (TIM3). De gegevens in figuur 3 zijn gemiddeld uit drie onafhankelijke runs en tonen aan dat cellen geen uitputting hebben bereikt. De Moffitt CTF ontwikkelde ook een resterende K562-test om de DP-onzuiverheden te bepalen die verband houden met de van K562 afgeleide aAPCs (figuur 4). De flowcytometrische gatingstrategie die werd gebruikt om de percentages van de celtypen te karakteriseren was als volgt: 1) gating op T- en NK-cellijnnegatieve populatie (CD3-CD56-CD16-); 2) poort op CD71+ (transferrinereceptor uitgedrukt in erytroïde afstamming en AML waardoor de detectie van resterende K562-cellen mogelijk is). Deze gating-strategie maakte de evaluatie mogelijk van de CD3-CD16-CD56-CD71+ cellen, die de aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (in figuur 4 “residuele K562” genoemd) zijn. Deze gating maakt de opsomming van residuele K562 in de uiteindelijke DP mogelijk door de frequentie van residuele K562 te vermenigvuldigen met de total viable count (TVC) telling van de DP (71+ × DP TVC = Residuele K562 cellen in de DP). Alle flowcytometrische gegevens worden gerapporteerd als de frequentie van levende cellen. Tabel 5 en figuur 4 geven de percentages T-cel- en NK-cellijnnegatieve en resterende K562-cellen weer. Een tweezijdige t-test werd uitgevoerd om de statistische significantie van de verschillen tussen deze populaties te bepalen en toonde aan dat er een significant verschil was tussen WCB en γδ T-cel DP en tussen WCB- en γδ T-cellen (t = 0,0019 voor T-cel en NK-cellijnnegatief; t < 0,0001 voor residueel K562 en t = 0,0314 voor T-cel en NK-cellijnnegatief; t < 0,0001 voor restnummer K562) (tabel 5). Figuur 1: Schematische weergave van de flowcytometrische gatingstrategie. Afkortingen: aAPC = , kunstmatige antigeen-presenterende cel; SSC-A = zijverstrooiingsgebied van de piek; FSC-A = voorwaarts spreidingsgebied van piek; SSC-H = zijverstrooiingshoogte van de piek; FSC-H = voorwaartse strooihoogte van de piek; CD = cluster van differentiatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Samenstelling van uitgangsmateriaal, tussenproducten en eindproduct van het geneesmiddel. Alle getoonde gegevens zijn gemiddeld van drie onafhankelijke runs. (A) Aferese van gezonde donoren ondergaat elutriatie met behulp van het tegenstroomcentrifugeerarmapparaat, wat resulteert in F2 (lymfocytenrijke fractie), die als uitgangsmateriaal wordt gebruikt. (B) F2 ondergaat gedurende 7 dagen Vγ9Vδ2 T-celspecifieke expansie met 5 μmol/l zoledroninezuur en 300 IE/ml IL-2 in 1 l medium aangevuld met 10% humaan AB-serum. (C) TCR αβ T-celdepletie wordt uitgevoerd op het zoledroninezuur-geëxpandeerde product. (D) Een zeer zuiver γδ T-celgeneesmiddel wordt geoogst na een tweede expansie van 10 dagen met doorstraalde aAPCs in een verhouding van 1:10 met 5 μmol/l zoledroninezuur en 300 IE/ml IL-2 in 1 l medium aangevuld met 10% humaan AB-serum. Afkortingen: NK = natural killer; CD = cluster van differentiatie; TCR= T-cel receptor; IL = interleukine; aAPCs = kunstmatige antigeen-presenterende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Biomarkers van uitgangsmateriaal, tussenproducten en eindproducten. Cellen worden verzameld en gekleurd voor CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 en TIM3 op dag 0-Counterflow Centrifugation F2-cellen, dag 7-zoledroninezuur-geëxpandeerde T-cellen, dag 7-TCR αβ T-celuitputting, dag 17-final drug product. Alle getoonde gegevens zijn gemiddeld van drie onafhankelijke runs. (A) Stem-like (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO-, en CCR7+) weergegeven als een totaal aantal levende cellen. (B) Centraal geheugen (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ en CCR7+) weergegeven als een percentage cd3+ TCR γδ+ cellen. Afkortingen: CD = cluster van differentiatie; TCR= T-cel receptor; IL = interleukine; . CCR7 = CC chemokine receptor 7; PD-1 = geprogrammeerd celdood eiwit-1; CTLA4 = cytotoxisch T-lymfocyt-geassocieerd eiwit 4; LAG3 = lymfocyten-activerend gen 3; TIM3 = T-cel immunoglobuline en mucinedomeinbevattend eiwit 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Representatieve gegevens van een K562-resttest (CD3-CD16-CD56-CD71+). Afkortingen: aAPC = kunstmatige antigeen-presenterende cel; NK = natural killer cel; SSC-A = zijverstrooiingsgebied van de piek; CD = cluster van differentiatie; IL = interleukine; TCR = T-cel receptor; MCB =master cell bank ; FMO = fluorescentie minus één; DP = geneesmiddel; WCB = werkende celbank. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Processtappen Parameters Donors Gemiddeld St. Dev. Run 1 Uitvoeren 2 Uitvoeren 3 Postverrijking (lymfocytenfractie F2) TVC Alle procesvalidaties werden gezaaid bij 109 TVC 1,00 x 109 1,00 x 109 1,00 x 109 1,00 x 109 0.00 Levensvatbaarheid (%) 98.6 96.6 92.2 95.8 3.27 CD20+ B-cellen (%) 15.6 23.4 15.2 18.07 4.62 CD3+ T-cel (%) 80.04 66.7 76.1 74.28 6.85 TCR αβ+ (%) 77.59 58.03 68.96 68.19 9.8 TCR γδ+ (%) 2.48 1.59 2.1 2.06 0.45 CD3-CD56+CD16+ NK cellen (%) 6.57 19.4 10.5 12.16 6.57 T-cel en NK-cellijn negatief (%) 13 13.7 13.4 13.37 0.35 Tabel 1: Samenvatting van lymfocytenverrijking door elutriatie gerapporteerd als frequentie van levende cellen. Afkortingen: TVC = total viable count; TCR = T-celreceptor; CD = cluster van differentiatie; NK = natural killer cel. Processtappen Parameters Donors Gemiddeld St. Dev. Run 1 Uitvoeren 2 Uitvoeren 3 7-daagse post-zoledroninezuurexpansie (pre-TCRαβ-depletie) Tvc 3,69 x 109 1,79 x 109 1,42 x 109 2,3 x 109 1,22 x 109 Levensvatbaarheid (%) 99.2 82.6 89.8 90.53 8.32 CD20+ B-cellen 2.1 11.5 7.08 6.89 4.7 CD3+ T-cel (%) 95.7 64.1 91.9 83.9 17.25 TCR αβ+ (%) 13.88 38.14 31.98 28 12.61 TCR γδ+ (%) 81.44 24.93 56.98 54.45 28.34 CD3-CD56+CD16+ NK cellen (%) 3.59 33.1 7.28 14.66 16.08 T-cel en NK-cellijn negatief (%) 0.67 2.7 0.82 1.4 1.13 Post-TCRαβ depletie Tvc 1,81 x 109 4,95 x 108 3,80 x 108 8,95 X108 7,94 x 108 Levensvatbaarheid van cellen (%) 98.8 87.6 89.8 92.07 5.93 CD20+ B-cellen 2.26 12 6.59 6.95 4.88 CD3+ T-cel (%) 95.8 45.3 89.7 76.93 27.56 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0.001 0.001 0.001 TCR γδ+ (%) 95.61 45.07 89.16 76.61 27.51 CD3-CD56+CD16+ NK cellen (%) 3.85 59.9 9.79 24.51 30.79 T-cel en NK-cellijn negatief (%) 0.34 1.72 0.45 0.84 0.77 TCR αβ+ TVC 0.00 4,95 x 103 3,8 x 103 2,92 x 103 2,59 x 103 TCR γδ+ TVC 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 x 108 7,64 x 108 8,39 x 108 CD3-CD56 + CD16 + NK TVC 6,97 x 107 2,97 x 108 3,72E+07 1,35 x 108 1,42 x 108 Tabel 2: Samenvatting van γδ T-celexpansie met zoledroninezuur en instrumentverrijking gerapporteerd als frequentie van levende cellen. Afkortingen:TVC = totaal levensvatbare telling; TCR = T-celreceptor; CD = cluster van differentiatie; NK = natural killer cel. Productkenmerken Parameters Donors Gemiddeld St. Dev. Run 1 Uitvoeren 2 Uitvoeren 3 Dag 0 γδ T Cellen 2,48 x 107 1,59 x 107 2,10 x 107 2,06 x 107 4,47 x 107 Dag 7 na verrijking γδ T Cellen 1,73 x 109 2,23 x 108 3,39 x 108 7,64 x 108 8,39 x 108 Vouwuitbreiding op dag 7 69.76 14.03 16.14 33.31 31.58 TVC bij de oogst* 8,14 x 1010 1,67 x 1010 6,84 x 1010 5,55 x 1010 3,42 x 1010 Levensvatbaarheid van cellen (%) 92.8 85.5 87.3 88.53 3.80 CD20+ B-cellen (%) 0.12 0.06 0.15 0.11 0.05 CD3+ T-cel (%) 97.8 52 97.5 82.43 26.36 TCR αβ+ (%) 0 0.001 0 0.00 0.00 TCR γδ+ (%) 97.51 50.13 97.21 81.62 27.27 CD3-CD56+CD16+ NK cellen (%) 2.16 47.3 1.71 17.06 26.19 T-cel en NK-cellijnnegatief, CD71+ Residueel K562 (%) 0.018 0.61 0.82 0.48 0.42 Totaal γδ T-cellen bij Harvest 7,93 X 1012 8,38 X 1011 6,65 x 1012 5,14 x 1012 3,78 x 1012 Totale vouwexpansie van γδ T-cellen (van dag 0 tot oogst) 3,20 x 105 5,27 x 104 3,17 x 105 2,30 x 105 1,53 x 105 *Procesvalidatie werd verkleind tot een kolf met een 5 X 106 γδ T-cel en 50 X106 bestraalde aAPCs. De gerapporteerde aantallen zijn voor een verwachte volledige run als 24 kolven worden gezaaid uit de D7-medicijnstof die werd gebruikt. Tabel 3: Samenvatting van γδ+ T-celcocultuur met aAPCs en uitgebreide γδ+ T-celoogst gerapporteerd als frequentie van levende cellen. *Procesvalidatie werd teruggebracht tot één bioreactor met gesloten systeem (capaciteit van 1 L) met 5 × 106 γδ T-cellen en 50 × 106 bestraalde AAPCs. De gerapporteerde aantallen zijn voor een verwachte volledige run als 24 kolven worden gezaaid uit de D7-medicijnsubstantie. Afkortingen: aAPCs = kunstmatige antigeen-presenterende cellen; TVC = totaal levensvatbare telling; TCR = T-celreceptor; CD = cluster van differentiatie; NK = natural killer cel. Test Parameter Acceptatiecriteria Resultaten Validatie 1 Validatie 2 Validatie 3 Levensvatbaarheid ≥ 70% 92.80% 85.50% 87.30% Mycoplasma Negatief Negatief Negatief Negatief Steriliteit No Growth Final (14 dagen) No Growth Final (14 dagen) No Growth Final (14 dagen) No Growth Final (14 dagen) Gram vlek Geen organismen gezien (NOS) NOS NOS NOS Endotoxine ≤ 2 EU/ml <0,50 EU/ml <0,50 EU/ml <0,50 EU/ml Tabel 4: Samenvatting van de resultaten van de kwaliteitscontrole voor de γδ T-cellen. Residuele K562-test K562 Wcb γδ Only γδ + WCB Product T- en NK-cellijn neg. % Residueel K562 % T- en NK-cellijn neg. % Residueel K562 % T- en NK-cellijn neg. % Residueel K562 % T- en NK-cellijn neg. % Residueel K562 % 99.4 98.8 98.7 96.83 3.49 0.58 0.48 0.07 99.2 98.31 99.5 98.21 12.8 0.38 3.87 0.71 98.9 98.6 97.6 95.55 N.V.T N.V.T 14.4 0.63 99.2 98.9 97.9 96.53 N.V.T N.V.T N.V.T N.V.T 98.7 98.3 98.6 97.6 N.V.T N.V.T N.V.T N.V.T Gemiddeld 99.08 98.58 98.46 96.94 8.15 0.48 6.25 0.47 St. Dev. 0.28 0.27 0.74 1.02 6.58 0.14 7.26 0.35 Tabel 5: T-cel en NK-cellijn-negatieve en residuele K562-percentages gerapporteerd als frequentie van levende cellen. Afkortingen: NK = natural killer cell; WCB = werkende celbank.

Discussion

Het Moffit Cell Therapy Lab heeft een protocol ontwikkeld met een bifasische expansie van zeer zuivere γδ T-cellen voor gebruik als DP in klinische onderzoeken. Dit protocol biedt een productiemethode onder cGMP-richtlijnen in een gesloten systeem dat een zeer zuivere γδ T-cel DP oplevert die met succes wordt geactiveerd en uitgebreid door zoledroninezuur en de WCB aAPCs. Dit protocol is goedgekeurd door de FDA voor de vervaardiging van een allogene γδ T-cel DP voor AML-patiënten. Met behulp van gezonde donoren hebben we met succes de kleine populatie donor γδ T-cellen in slechts 7 dagen uitgebreid van 2,06 ± 0,45% naar 54,45 ± 28,34%. Na de 7-daagse expansie met zoledroninezuur werd waargenomen dat donor 2 een toename van de NK-populatie had.

Zoledroninezuur remt farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten, wat op zijn beurt leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat (IPP), wat is gecorreleerd met een significante toename van de proliferatie van T-cellen en natuurlijke NK-cellen7,8,9. Deze toegenomen NK-populatie belemmert de 2e fase van expansie met de aAPCs, omdat de aAPCs alleen maar zullen bijdragen aan de verdere uitbreiding van NK-cellen. Om deze reden zijn de donorcriteria aangepast om donoren met een hoge NK-populatie uit te sluiten. Na depletie van de αβ T-cellen werden de γδ T-cellen verder verrijkt tot 76,61 ± 27,51%. Dit unieke protocol bevat een tweede uitbreiding met behulp van de door Moffit vervaardigde aAPCs om zich te richten op de CD8-, CD28- en CD127L-receptoren in de γδ T-cellen. Deze tweede expansiefase met de aAPCs leverde een DP op met ≥65% voor CD3+TCR γδ+ T cellen, ≤1% TCRαβ T en <35% CD3-CD16+CD56+ NK cellen. Vanwege het gebruik van van K562 afgeleide aAPCs moest worden aangetoond dat deze aAPCs <1% van het eindproduct uitmaakten.

De Moffit CTF ontwikkelde een flowcytometrische assay die wordt gebruikt voor de afgiftecriteria om het percentage resterende K562-cellen in de uiteindelijke DP te meten. Deze flowcytometrische test vermindert alle problemen van het gebruik van celoppervlakantigenen om de K562-cellen te identificeren. Omdat geactiveerde T-cellen CD71 kunnen uitdrukken, hebben we een strategie bedacht om alle T-cellen en NK-cellen uit te sluiten door gating op CD3 CD56 en CD16-populaties en vervolgens de CD71 + -cellen te onderzoeken, die uitsluitend K562-cellen zouden zijn. Dit protocol toont aan dat de γδ T-cel DP 0,48 ± 0,42% resterende K562-cellen oplevert en voldoet aan alle afgiftecriteria van ≥70% levensvatbaarheid, Mycoplasma negativiteit door PCR, geen organismen gezien door gramkleuring, ≤2 EU / ml endotoxine en geen groeifinale (14 dagen) bloedkweeksteriliteit.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken de Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity van Moffitt Cancer Center voor het verstrekken van de financiering voor deze protocolontwikkeling. We bedanken ook Dr. Claudio Anasetti voor zijn onschatbare hulp en begeleiding bij dit project. Tot slot bedanken we Dr. Justin Boucher voor zijn inzichten en beoordeling van het manuscript.

Materials

Hanks Balanced Salt Solution R&D 285-GMP
Human Albumin 25% Grifolis 65483-16-071
Plasmalyte A Fisher 2B2543Q
Zoledronic Acid (Zometa) Hos pira 4215-04–8 FDA approved drug
DMSO WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH WAK-DMSO-10
CS10 BIOLIFE SOLUTIONS 210374
3 mL syringe BD 309657
10 mL syringe BD 309604
20 mL syringe BD 302830
50 mL syringe BD 309653
100 mL syringe JMS 992861
18g Needle Fisher 305198
Cryovials 1.8 mL Fisher 375418
5 mL pipette Fisher 1367811D
50 mL pipette Fisher 1367610Q
10 mL pipette Fisher 1367811E
100 mL pipette Fisher 07-200-620
15 mL conical Fisher 05-539-12
50 mL conical Fisher 05-539-7
250 mL conical Fisher 430776
600 mL Transfer Pack TERUMO BCT INC 1BBT060CB71
4" Plasma Transfer Set INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES 03-220-90
Elutra Tubing Set TerumoBCT 70800
100 MCS GREX WILSON WOLF MFG CORP 81100-CS
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system Fisher Scientific 22-246660
Acacia Pump boot MPS Medical In 17789HP3MLL
CliniMACS PBS/EDTA Buffer Miltenyi Biotec Inc 130-070-525
Dornase Alpha Genentech, Inc 50242-100-40/186-0055 FDA approved drug
1000 mL 0.22 um Filter Fisher 157-0020
Blood Filter 170um B.Braun V2500
CliniMACs Tubing set Miltenyi Biotec Inc 130-090-719
CliniMACS TCRα/β Kit Miltenyi Biotec Inc 130-021-301
Y-Type blood set Fenwal FWL4C2498H
75 mL Flask Fisher 430641U
IL-2 Prometheus 65483-116-071 FDA approved drug
AIM-V Fisher 0870112BK
Human AB serum Gemini Bio-Product 100H41T
3 Liter Transfer pack Independent Medical Associates T3109
1000  pipette tips Fisher Scientific 5991040
CF-250 KOLBio CF-250
Elutra TERUMOBCT
CliniMACS Miltenyi Biotec Inc
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump WILSON WOLF MFG CORP
HERAcell Vios CO2 Incubator Thermo Scientific

References

  1. Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
  2. Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
  3. Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
  4. Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
  5. Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
  6. Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
  7. Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
  8. Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
  9. Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).

Play Video

Cite This Article
Landin, A. M., Cox, C., Yu, B., Bejanyan, N., Davila, M., Kelley, L. Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (γδ) T Cells from Apheresed Human Product. J. Vis. Exp. (175), e62622, doi:10.3791/62622 (2021).

View Video