Gepresenteerd is een protocol voor de uitbreiding van Gamma-Delta (γδ) T-cel geneesmiddel product. Lymfocyten worden geïsoleerd door elutriatie en γδ-verrijkt met zoledroninezuur en interleukine-2. Alfa-bèta T-cellen worden uitgeput met behulp van een magnetisch scheidingsapparaat van klinische kwaliteit. De γδ-cellen worden samen met K562-afgeleide, kunstmatige antigeen-presenterende cellen en uitgebreid.
Hoewel Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, is deze populatie gewild vanwege zijn vermogen om antigenen op een belangrijke histocompatibiliteitscomplex (MHC) -onafhankelijke manier te herkennen en een sterke cytolytische effectorfunctie te ontwikkelen die het een ideale kandidaat maakt voor kankerimmunotherapie. Vanwege de lage frequentie van Gamma-Delta (γδ) T-cellen in het perifere bloed, ontwikkelden we een effectief protocol om een zeer zuiver γδ T-cellengeneesmiddel sterk uit te breiden voor het eerste gebruik van allogene γδ T-cellen bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Met behulp van gezonde donoraferese als allogene celbron worden de lymfocyten geïsoleerd met behulp van een gevalideerd apparaat voor een tegenstroomcentrifugatiemethode om cellen te scheiden op grootte en dichtheid.
De lymfocytenrijke fractie wordt gebruikt en de γδ T-cellen worden bij voorkeur geactiveerd met zoledroninezuur (FDA-goedgekeurd) en interleukine (IL) -2 gedurende 7 dagen. Na de preferentiële expansie van γδ T-cellen worden een magnetisch celscheidingsapparaat van klinische kwaliteit en TCRαβ-kralen gebruikt om contaminerende T-celreceptor (TCR)αβ T-cellen uit te putten. De sterk verrijkte γδ T-cellen ondergaan vervolgens een tweede expansie met behulp van gemanipuleerde kunstmatige antigeen-presenterende cellen (aAPCs) afgeleid van K562-cellen – genetisch gemanipuleerd om single-chain variabel fragment (scFv) tot expressie te brengen voor CD3 en CD28, 41BBL (CD137L) en IL15-RA- samen met zoledroninezuur en IL-2. Het zaaien van alle dag-7 verrijkte γδ T-cellen in co-kweek met de aAPCs vergemakkelijkt de vervaardiging van zeer zuivere γδ T-cellen met een gemiddelde vouwuitbreiding van >229.000-voudig uit gezond donorbloed.
Leukemie-terugval is de belangrijkste doodsoorzaak na hematopoëtische celtransplantatie (HCT) bij patiënten met AML1,2,3. Betere leukemievrije overleving werd gemeld met het verhoogde herstel van bloed γδ T-cellen na HCT zonder verhoogd risico op Graft-versus-Host Disease (GVHD)4. Het vermogen van γδ T-cellen om antigenen op een MHC-onafhankelijke manier te herkennen en sterke cytolytische en Th1-achtige effectorfuncties te ontwikkelen, maakt deze kleine subpopulatie van T-cellen ideaal voor de behandeling van AML-patiënten die een allogene transplantatie ondergaan met een risico op terugval5. Aangezien de Vγ9Vδ2 T-cellen een kleine subset van T-lymfocyten zijn, variërend van 0,5% tot 5% van de T-cellen in de periferie6, wilden we een robuust systeem opzetten om deze zeldzame populatie van bloedcellen uit te breiden om potentieel therapeutische doses voor klinische onderzoeken te bereiken.
Hoewel anderen met succes γδ T-cellen hebben uitgebreid met behulp van zoledroninezuur en zelfs AAPCs, hebben we een proces ontwikkeld dat mogelijk γδ T-cellen met 229.749-voudig kan uitbreiden. De expansie is bifasisch: eerst worden lymfocyten verkregen door elutriatie met behulp van het scheidingsinstrument. De apparatuur biedt een gesloten systeem dat de scheiding van cellen mogelijk maakt op basis van hun grootte, vorm en dichtheid door tegenstroomcentrifugatie. Na verrijking voor lymfocyten wordt selectieve expansie van Vγ9Vδ2 T-cellen bereikt door behandeling met zoledroninezuur en IL-2 gedurende 7 dagen. Onmiddellijk na deze behandeling worden TCR-αβ T-cellen uitgeput met behulp van microbead-technologie, waardoor de γδ T-cellen vervolgens kunnen worden uitgebreid met K562-afgeleide aAPCs.
Voor procesvalidatie werden slechts 5 × 106 zoledroninezuur-geëxpandeerde γδ T-cellen gebruikt voor de fase-2 co-cultuur expansie met aAPCs. In deze tweede fase van uitbreiding worden γδ T-cellen geactiveerd met behulp van een huidige Good Manufacturing Practices (cGMP)-conforme Working Cell Bank (WCB) van genetisch gemanipuleerde K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) vervaardigd in Moffitt. De redenering van deze bifasische expansie is gebaseerd op het vermogen van zoledroninezuur om farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten te remmen, wat leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat, dat de Vγ2Vδ2-cellen direct stimuleert. In de tweede fase van expansie bieden de K562-afgeleide aAPCs (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) een robuuste stimulatie aan alle T-cellen. Het celproduct is echter al verrijkt voor de γδ T-cellen, wat resulteert in een robuuste expansie van de γδ T-cellen.
Met behulp van specifieke apparatuur en kolven is het proces een functioneel gesloten systeem, waardoor het risico op besmetting wordt verminderd. Bovendien vergemakkelijkt de 1 L bioreactor met gesloten systeem maximale groei en expansie van cellen in een totaal volume van 1 L medium met minimale behoefte aan voeding. Het voordeel van de Moffitt-methode is dat het een snel, reproduceerbaar en zeer haalbaar GMP-systeem biedt om een zeer zuiver, van donor afgeleid γδ T-celproduct te produceren voor allogene toediening. Deze methode kan worden toegepast op elke klinische studie die gericht is op het gebruik van menselijke γδ T-cellen die Vγ2Vδ2 T-celreceptoren tot expressie brengen als adoptieve immunotherapie om immuniteit tegen microben en tumoren te bemiddelen bij kankerpatiënten met gedeeltelijke en volledige remissie. Daarnaast biedt het een robuust platform voor de ontwikkeling en productie van γδ chimere antigeenreceptorpositieve (CAR+) T-cellen.
Het Moffit Cell Therapy Lab heeft een protocol ontwikkeld met een bifasische expansie van zeer zuivere γδ T-cellen voor gebruik als DP in klinische onderzoeken. Dit protocol biedt een productiemethode onder cGMP-richtlijnen in een gesloten systeem dat een zeer zuivere γδ T-cel DP oplevert die met succes wordt geactiveerd en uitgebreid door zoledroninezuur en de WCB aAPCs. Dit protocol is goedgekeurd door de FDA voor de vervaardiging van een allogene γδ T-cel DP voor AML-patiënten. Met behulp van gezonde donoren hebben we met succes de kleine populatie donor γδ T-cellen in slechts 7 dagen uitgebreid van 2,06 ± 0,45% naar 54,45 ± 28,34%. Na de 7-daagse expansie met zoledroninezuur werd waargenomen dat donor 2 een toename van de NK-populatie had.
Zoledroninezuur remt farnesyldifosfaatsynthase (FDPS) in monocyten, wat op zijn beurt leidt tot de accumulatie van isopentenylpyrofosfaat (IPP), wat is gecorreleerd met een significante toename van de proliferatie van T-cellen en natuurlijke NK-cellen7,8,9. Deze toegenomen NK-populatie belemmert de 2e fase van expansie met de aAPCs, omdat de aAPCs alleen maar zullen bijdragen aan de verdere uitbreiding van NK-cellen. Om deze reden zijn de donorcriteria aangepast om donoren met een hoge NK-populatie uit te sluiten. Na depletie van de αβ T-cellen werden de γδ T-cellen verder verrijkt tot 76,61 ± 27,51%. Dit unieke protocol bevat een tweede uitbreiding met behulp van de door Moffit vervaardigde aAPCs om zich te richten op de CD8-, CD28- en CD127L-receptoren in de γδ T-cellen. Deze tweede expansiefase met de aAPCs leverde een DP op met ≥65% voor CD3+TCR γδ+ T cellen, ≤1% TCRαβ T en <35% CD3-CD16+CD56+ NK cellen. Vanwege het gebruik van van K562 afgeleide aAPCs moest worden aangetoond dat deze aAPCs <1% van het eindproduct uitmaakten.
De Moffit CTF ontwikkelde een flowcytometrische assay die wordt gebruikt voor de afgiftecriteria om het percentage resterende K562-cellen in de uiteindelijke DP te meten. Deze flowcytometrische test vermindert alle problemen van het gebruik van celoppervlakantigenen om de K562-cellen te identificeren. Omdat geactiveerde T-cellen CD71 kunnen uitdrukken, hebben we een strategie bedacht om alle T-cellen en NK-cellen uit te sluiten door gating op CD3– CD56– en CD16-populaties en vervolgens de CD71 + -cellen te onderzoeken, die uitsluitend K562-cellen zouden zijn. Dit protocol toont aan dat de γδ T-cel DP 0,48 ± 0,42% resterende K562-cellen oplevert en voldoet aan alle afgiftecriteria van ≥70% levensvatbaarheid, Mycoplasma negativiteit door PCR, geen organismen gezien door gramkleuring, ≤2 EU / ml endotoxine en geen groeifinale (14 dagen) bloedkweeksteriliteit.
The authors have nothing to disclose.
We bedanken de Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity van Moffitt Cancer Center voor het verstrekken van de financiering voor deze protocolontwikkeling. We bedanken ook Dr. Claudio Anasetti voor zijn onschatbare hulp en begeleiding bij dit project. Tot slot bedanken we Dr. Justin Boucher voor zijn inzichten en beoordeling van het manuscript.
Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04–8 | FDA approved drug |
DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | |
10 mL syringe | BD | 309604 | |
20 mL syringe | BD | 302830 | |
50 mL syringe | BD | 309653 | |
100 mL syringe | JMS | 992861 | |
18g Needle | Fisher | 305198 | |
Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
250 mL conical | Fisher | 430776 | |
600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
Elutra | TERUMOBCT | ||
CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |