Caracterización de los miRNAs asociados funcionalmente en el glioblastoma y su ingeniería en clústeres artificiales para la terapia génica
Summary
Aquí se describe un protocolo para caracterizar módulos de miRNAs biológicamente sinérgicos y su ensamblaje en transgenes cortos, lo que permite la sobreexpresión simultánea para aplicaciones de terapia génica.
Abstract
La relevancia biológica de los microARN (miRNAs) en salud y enfermedad se basa significativamente en combinaciones específicas de muchos miRNAs desregulados simultáneamente en lugar de la acción de un solo miRNA. La caracterización de estos módulos miRNAs específicos es un paso fundamental para maximizar su uso en la terapia. Esto es extremadamente relevante porque sus atributos combinatoriales pueden ser prácticamente explotados. Aquí se describe un método para definir una firma específica de miRNA relevante para el control de los represores de cromatina oncogénica en el glioblastoma. El enfoque define primero un grupo general de miRNAs que se desreglamentan en los tumores en comparación con el tejido normal. El análisis se perfecciona aún más mediante condiciones de cultivo diferencial, subrayando un subgrupo de miRNAs que se expresan simultáneamente durante estados celulares específicos. Por último, los miRNAs que satisfacen estos filtros se combinan en un transgenes policistrónicos artificiales, que se basa en un andamio de genes de agrupaciones de miRNA naturalmente existentes, luego se utilizan para la sobreexpresión de estos módulos de miRNA en las células receptoras.
Introduction
los miRNAs ofrecen una oportunidad inigualable para el desarrollo de un enfoque amplio de terapia génica para muchas enfermedades1,2,3, incluyendo el cáncer4,5. Esto se basa en varias características únicas de estas moléculas biológicas, incluyendo su pequeño tamaño6, biogénesis simple7,y tendencia natural a funcionar en la asociación8. Muchas enfermedades se caracterizan por patrones específicos de expresión de miRNA, que a menudo convergen en la regulación de funciones biológicas complejas9. El propósito de este método es primero definir una estrategia para identificar grupos de miRNAs que son sinérgicamente relevantes para funciones celulares específicas. En consecuencia, proporciona una estrategia para el restablecimiento de tales combinaciones de miRNA en estudios y aplicaciones posteriores.
Este método permite el análisis funcional de múltiples miRNAs a la vez, aprovechando su segmentación simultánea de un gran número de ARNm, recapitulando así los complejos paisajes de las enfermedades. Este enfoque se ha empleado recientemente para definir un grupo de tres miRNAs que 1) están simultáneamente regulados en cáncer cerebral y 2) muestran un fuerte patrón de coexpresión durante la diferenciación neuronal, así como en respuesta al estrés genotóxico por radiación o un Agente alquilante de ADN. La re-expresión combinatoria de este módulo de tres miRNAs por el método de agrupación que se describe a continuación da lugar a una profunda interferencia con la biología de las células cancerosas y se puede utilizar fácilmente como estrategia de terapia génica para estudios preclínicos10. Este protocolo puede ser de particular interés para los involucrados en la investigación de miRNA y sus aplicaciones traslacionales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se basa en la noción de que en lugar de funcionar de forma aislada, los miRNAs son biológicamente relevantes al trabajar en grupos, y estos grupos están determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar este enfoque desde una perspectiva traslacional, se introduce un protocolo de seguimiento que permite la recreación de este patrón multi-miRNA en células/tejidos. Esto es posible aprovechando la biogénesis relativamente simple de los miR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los miembros del Laboratorio de Neurooncología Harvey Cushing por su apoyo y crítica constructiva. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NINDS K12NS80223 y K08NS101091 a P. P.
Materials
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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