Summary

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Abstract

La rilevanza biologica dei microRNA (miRNA) nella salute e nella malattia si basa in modo significativo su combinazioni specifiche di molti miRNA contemporaneamente deregolamentati piuttosto che sull’azione di un singolo miRNA. La caratterizzazione di questi moduli specifici di miRNA è un passo fondamentale per massimizzare il loro uso in terapia. Questo è estremamente rilevante perché i loro attributi combinatori possono essere praticamente sfruttati. Descritto qui è un metodo per definire una firma miRNA specifica rilevante per il controllo dei repressori di cromatina oncogenia nel glioblastoma. L’approccio definisce prima un gruppo generale di miRNA che sono deregolati nei tumori rispetto al tessuto normale. L’analisi viene ulteriormente perfezionata dalle condizioni di coltura differenziali, sottolineando un sottogruppo di miRNA che vengono co-espressi contemporaneamente durante specifici stati cellulari. Infine, i miRNA che soddisfano questi filtri sono combinati in un transgene policistronico artificiale, che si basa su uno scaffolding di geni di cluster miRNA naturalmente esistenti, quindi utilizzati per la sovraespressione di questi moduli miRNA nelle cellule riceventi.

Introduction

I miRNA offrono un’opportunità ineguagliabile per lo sviluppo di un ampio approccio di terapia genica a molte malattie1,2,3, compreso il cancro4,5. Questo si basa su diverse caratteristiche uniche di queste molecole biologiche, tra cui la loro piccola dimensione6, semplice biogenesi7, e la tendenza naturale a funzionare in associazione8. Molte malattie sono caratterizzate da specifici modelli di espressione del miRNA, che spesso convergono sulla regolazione di funzioni biologiche complesse9. Lo scopo di questo metodo è innanzitutto quello di definire una strategia per identificare gruppi di miRNA che sono sinergicamente rilevanti per funzioni cellulari specifiche. Di conseguenza, fornisce una strategia per il ripristino di tali combinazioni di miRNA in studi e applicazioni a valle.

Questo metodo consente l’analisi funzionale di più miRNA contemporaneamente, sfruttando il loro targeting simultaneo di un gran numero di mRNA, ricapitolando così i complessi paesaggi delle malattie. Questo approccio è stato recentemente impiegato per definire un gruppo di tre miRNA che 1) sono contemporaneamente downregolati nel cancro al cervello e 2) mostrano un forte modello di co-espressione durante la differenziazione neurale, nonché in risposta allo stress genotossico da radiazioni o un Agente alchiante del DNA. La riequivocazione combinatoria di questo modulo di tre miRNA con il metodo di clustering descritto di seguito si traduce in una profonda interferenza con la biologia delle cellule tumorali e può essere facilmente utilizzata come strategia di terapia genica per studi preclinici10. Questo protocollo può essere di particolare interesse per coloro che sono coinvolti nella ricerca sui miRNA e sulle sue applicazioni traslazionali.

Protocol

1. Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente in Glioblastoma Analisi dell’espressione di miRNA differenziale ampia nel glioblastoma rispetto al cervello In primo luogo, determinare i miRNA più significativamente deregolamentati nel tumore. Ciò può essere ottenuto utilizzando almeno tre diversi metodi: Estrarre l’Atlante del Genoma del Cancro, trovato a https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, per i dati di sequenziament…

Representative Results

Questo metodo ha permesso la caratterizzazione di un modulo di tre miRNA che sono costantemente downregolati nei tumori cerebrali, che sono co-espressi specificamente durante la differenziazione neuronale (Figura 1) e coinvolti nella risposta di sopravvivenza del tumore dopo terapia (Figura 2). Ciò si ottiene regolando un complesso percorso repressivo della cromatina oncogenica. Questo modello di co-espressione ha suggerito una …

Discussion

Questo protocollo si basa sulla nozione che, invece di funzionare in isolamento, i miRNA sono biologicamente rilevanti lavorando in gruppi, e questi gruppi sono stabiliti trascrizionalmente da contesti cellulari specifici26. Per giustificare questo approccio da una prospettiva traslazionale, viene introdotto un protocollo di follow-up che consente la ricreazione di questo modello multi-miRNA nelle cellule/tessuti. Ciò è possibile sfruttando la biogenesi relativamente semplice dei miRNA, per cui …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare i membri del Laboratorio di Oncologia Neuro Harvey Cushing per il sostegno e la critica costruttiva. Questo lavoro è stato supportato da NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.

Materials

0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5-mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

References

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Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

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