Summary

توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم الصفراوي وهندستها إلى مجموعات اصطناعية للعلاج الجيني

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.

Abstract

الاهميه البيولوجية ميكرورناس (miRNAs) في مجال الصحة والمرض تعتمد بشكل كبير علي مجموعات محدده من العديد من المحررين في وقت واحد miRNAs بدلا من عمل ميرنا واحده. وصف هذه الوحدات miRNAs محدده خطوه أساسيه في تعظيم استخدامها في العلاج. وهذا أمر مهم للغاية لأنه يمكن استغلال سماتهم التوافقية عمليا. وصفت هنا هو طريقه لتحديد توقيع ميرنا محدده ذات الصلة للسيطرة علي المتحكمين الكروماتين في الورم الارومي. يعرف النهج أولا مجموعه عامه من miRNAs التي يتم تحريرها في الأورام بالمقارنة مع الانسجه العادية. ويتم صقل التحليل بشكل أكبر من خلال الظروف الثقافية التفاضلية ، مما يؤكد وجود مجموعه فرعيه من miRNAs التي يتم التعبير عنها بشكل متزامن اثناء الولايات الخلوية المحددة. وأخيرا ، فان miRNAs التي ترضي هذه المرشحات يتم دمجها في الجينات الاصطناعية متعددة الخلايا ، والتي تقوم علي سقالة من الجينات الموجودة بشكل طبيعي المجموعات ميرنا ، ثم تستخدم للتعبير المفرط من هذه الوحدات ميرنا في الخلية المتلقية.

Introduction

mirnas توفر فرصه لا مثيل لها لتطوير نهج العلاج الجيني واسعه لكثير من الامراض1،2،3، بما في ذلك السرطان4،5. ويستند هذا علي العديد من السمات الفريدة لهذه الجزيئات البيولوجية ، بما في ذلك حجمها الصغير6، التكوين الحيوي البسيط7، والميل الطبيعي للعمل في الرابطة8. وتتميز العديد من الامراض بأنماط التعبير ميرنا محدده ، والتي غالبا ما تتلاقي علي تنظيم الوظائف البيولوجية المعقدة9. والغرض من هذا الأسلوب هو أولا لتحديد استراتيجية لتحديد مجموعات miRNAs التي هي بالتازر ذات الصلة لوظائف خلوية معينه. التالي ، فانه يوفر استراتيجية لأعاده إنشاء مثل هذه التركيبات في الدراسات والتطبيقات النهائية.

هذا الأسلوب يسمح للتحليل الوظيفي للعديد من miRNAs في وقت واحد ، والاستفادة من استهدافهم في وقت واحد من عدد كبير من mRNAs ، التالي تلخيص المناظر الطبيعية المعقدة من الامراض. وقد استخدم هذا النهج مؤخرا لتحديد مجموعه من ثلاثه mirnas ان 1) هي في وقت واحد دوونريجولاتيد في سرطان المخ و 2) تظهر نمط التعبير المشترك قويه خلال التمايز العصبي وكذلك ردا علي الإجهاد الجيني من قبل الإشعاع أو الحمض النووي عامل الالكل. التوافقية أعاده التعبير عن هذه الوحدة من ثلاثه miRNAs بواسطة طريقه التجميع الموصوفة أدناه النتائج في التدخل العميق مع بيولوجيا الخلايا السرطانية ويمكن استخدامها بسهوله كاستراتيجية العلاج الجيني للدراسات قبل السريرية10. وقد يكون هذا البروتوكول ذا اهميه خاصه بالنسبة لأولئك المشاركين في بحوث ميرنا وتطبيقاتها الانتقالية.

Protocol

1. توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم المفلطح تحليل التعبير ميرنا التفاضلي الواسع في الورم الدمى مقابل المخ أولا ، تحديد الأكثر بشكل ملحوظ التي حررت miRNAs في الورم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام ثلاث طرق مختلفه علي الأقل: منجم السرطان الجينوم الأطلس ، وجدت في https://www.cancer.gov/a…

Representative Results

سمحت هذه الطريقة توصيف وحده من ثلاثه miRNAs التي يتم تقليلها باستمرار في أورام المخ ، والتي يتم التعبير عنها بشكل خاص اثناء التمايز العصبية (الشكل 1) وتشارك في استجابه الورم البقاء علي قيد الحياة بعد العلاج (الشكل 2). ويتحقق ذلك من خلال تنظيم ال…

Discussion

ويستند هذا البروتوكول علي فكره انه بدلا من العمل في عزله ، miRNAs هي ذات الصلة بيولوجيا من خلال العمل في مجموعات ، ويتم تحديد هذه المجموعات الهيستونات من قبل السياقات الخلوية المحددة26. ولتبرير هذا النهج من منظور انتقالي ، استحدث بروتوكول للمتابعة يسمح بالترويح عن هذا النمط المت?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا أعضاء مختبر هارفي كوشينج للأورام العصبية علي الدعم والنقد البناء. وقد دعم هذا العمل من قبل NINDS منح K12NS80223 و K08NS101091 إلى p. P.

Materials

0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5-mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

References

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

View Video