وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.
الاهميه البيولوجية ميكرورناس (miRNAs) في مجال الصحة والمرض تعتمد بشكل كبير علي مجموعات محدده من العديد من المحررين في وقت واحد miRNAs بدلا من عمل ميرنا واحده. وصف هذه الوحدات miRNAs محدده خطوه أساسيه في تعظيم استخدامها في العلاج. وهذا أمر مهم للغاية لأنه يمكن استغلال سماتهم التوافقية عمليا. وصفت هنا هو طريقه لتحديد توقيع ميرنا محدده ذات الصلة للسيطرة علي المتحكمين الكروماتين في الورم الارومي. يعرف النهج أولا مجموعه عامه من miRNAs التي يتم تحريرها في الأورام بالمقارنة مع الانسجه العادية. ويتم صقل التحليل بشكل أكبر من خلال الظروف الثقافية التفاضلية ، مما يؤكد وجود مجموعه فرعيه من miRNAs التي يتم التعبير عنها بشكل متزامن اثناء الولايات الخلوية المحددة. وأخيرا ، فان miRNAs التي ترضي هذه المرشحات يتم دمجها في الجينات الاصطناعية متعددة الخلايا ، والتي تقوم علي سقالة من الجينات الموجودة بشكل طبيعي المجموعات ميرنا ، ثم تستخدم للتعبير المفرط من هذه الوحدات ميرنا في الخلية المتلقية.
mirnas توفر فرصه لا مثيل لها لتطوير نهج العلاج الجيني واسعه لكثير من الامراض1،2،3، بما في ذلك السرطان4،5. ويستند هذا علي العديد من السمات الفريدة لهذه الجزيئات البيولوجية ، بما في ذلك حجمها الصغير6، التكوين الحيوي البسيط7، والميل الطبيعي للعمل في الرابطة8. وتتميز العديد من الامراض بأنماط التعبير ميرنا محدده ، والتي غالبا ما تتلاقي علي تنظيم الوظائف البيولوجية المعقدة9. والغرض من هذا الأسلوب هو أولا لتحديد استراتيجية لتحديد مجموعات miRNAs التي هي بالتازر ذات الصلة لوظائف خلوية معينه. التالي ، فانه يوفر استراتيجية لأعاده إنشاء مثل هذه التركيبات في الدراسات والتطبيقات النهائية.
هذا الأسلوب يسمح للتحليل الوظيفي للعديد من miRNAs في وقت واحد ، والاستفادة من استهدافهم في وقت واحد من عدد كبير من mRNAs ، التالي تلخيص المناظر الطبيعية المعقدة من الامراض. وقد استخدم هذا النهج مؤخرا لتحديد مجموعه من ثلاثه mirnas ان 1) هي في وقت واحد دوونريجولاتيد في سرطان المخ و 2) تظهر نمط التعبير المشترك قويه خلال التمايز العصبي وكذلك ردا علي الإجهاد الجيني من قبل الإشعاع أو الحمض النووي عامل الالكل. التوافقية أعاده التعبير عن هذه الوحدة من ثلاثه miRNAs بواسطة طريقه التجميع الموصوفة أدناه النتائج في التدخل العميق مع بيولوجيا الخلايا السرطانية ويمكن استخدامها بسهوله كاستراتيجية العلاج الجيني للدراسات قبل السريرية10. وقد يكون هذا البروتوكول ذا اهميه خاصه بالنسبة لأولئك المشاركين في بحوث ميرنا وتطبيقاتها الانتقالية.
ويستند هذا البروتوكول علي فكره انه بدلا من العمل في عزله ، miRNAs هي ذات الصلة بيولوجيا من خلال العمل في مجموعات ، ويتم تحديد هذه المجموعات الهيستونات من قبل السياقات الخلوية المحددة26. ولتبرير هذا النهج من منظور انتقالي ، استحدث بروتوكول للمتابعة يسمح بالترويح عن هذا النمط المت?…
The authors have nothing to disclose.
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا أعضاء مختبر هارفي كوشينج للأورام العصبية علي الدعم والنقد البناء. وقد دعم هذا العمل من قبل NINDS منح K12NS80223 و K08NS101091 إلى p. P.
0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |