Summary

Glioblastoma'da İşlevsel İlişkili MiRNA'ların Ve Bunların Mühendisliğinin Gen Tedavisi İçin Yapay Kümelere Dönüştürülmesi

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Burada tanımlanan biyolojik sinerjik miRNA’ların modüllerini ve bunların kısa transgenlere dönüştürülmesiiçin bir protokoldür, bu da gen terapisi uygulamaları için eşzamanlı aşırı ekspresyon sağlar.

Abstract

MikroRNA’ların (miRNA’ların) sağlık ve hastalıktaki biyolojik önemi, tek bir miRNA’nın eylemi yerine aynı anda deregüle edilmiş birçok miRNA’nın belirli kombinasyonlarına dayanır. Bu özel miRNA modüllerinin karakterizasyonu, tedavide kullanımlarını en üst düzeye çıkarmada temel bir adımdır. Bu son derece alakalıdır, çünkü kombinatoryal öznitelikleri pratik olarak kullanılabilir. Burada açıklanan glioblastoma onkojenik kromatin represörlerin kontrolü ile ilgili belirli bir miRNA imza tanımlamak için bir yöntemdir. Yaklaşım ilk olarak tümörlerde normal dokuya göre deregulated olan genel bir miRNA grubunu tanımlar. Analiz, diferansiyel kültür koşullarına göre daha da rafine edilerek, belirli hücresel durumlar sırasında aynı anda ifade edilen miRNA’ların bir alt grubunun altını çizer. Son olarak, bu filtreleri karşılayan miRNA’lar, doğal olarak var olan miRNA kümelerinin genlerinin bir iskelesine dayanan ve daha sonra bu miRNA modüllerinin alıcı hücrelere aşırı ekspresyonu için kullanılan yapay bir polikistronik transgende birleştirilir.

Introduction

miRNA’lar birçok hastalığa geniş bir gen terapisi yaklaşımının geliştirilmesi için eşsiz bir fırsat sunuyoruz1,2,3, kanser dahil4,5. Bu küçük boyutu6dahil olmak üzere bu biyolojik moleküllerin çeşitli benzersiz özellikleri dayanmaktadır, basit biyogenez7, ve ilişki içinde işlev doğal eğilim8. Birçok hastalık genellikle karmaşık biyolojik fonksiyonların düzenlenmesi üzerinde yakınsama belirli miRNA ekspresyon desenleri ile karakterizedir9. Bu yöntemin amacı ilk olarak belirli hücresel fonksiyonlar için sinerjik olarak ilgili miRNA gruplarını tanımlamak için bir strateji tanımlamaktır. Sonuç olarak, bu tür miRNA kombinasyonlarının downstream çalışmalarda ve uygulamalarda yeniden kurulması için bir strateji sağlar.

Bu yöntem, birden fazla miRNA’nın aynı anda fonksiyonel analizini sağlar, çok sayıda mRNA’yı eşzamanlı olarak hedeflemelerinden yararlanarak hastalıkların karmaşık manzaralarını özetlemektedir. Bu yaklaşım son zamanlarda üç miRNA’lardan oluşan bir grubu tanımlamak için kullanılmıştır ki 1) aynı anda beyin kanserinde göz denir ve 2) sinirsel farklılaşma sırasında güçlü bir ko-ekspresyon paterni göstermek yanı sıra radyasyon veya bir genotoksik strese yanıt olarak DNA alkilleyici ajan. Üç miRNA’dan oluşan bu modülün, aşağıda açıklanan kümeleme yöntemi ile kombinatoryal yeniden ekspresyonu, kanser hücrelerinin biyolojisi ile derin bir girişimle sonuçlanır ve klinik öncesi çalışmalar için gen terapisi stratejisi olarak kolayca kullanılabilir10. Bu protokol miRNA araştırmave çeviri uygulamaları dahil olanlar için özel ilgi olabilir.

Protocol

1. Glioblastoma’da Fonksiyonel İlişkili MiRNA’ların Karakterizasyonu Glioblastoma vs beyinde geniş diferansiyel miRNA ekspresyonunun analizi İlk olarak, tümörde en önemli deregulated miRNA’ları belirleyin. Bu, en az üç farklı yöntem kullanılarak elde edilebilir: Mine Kanser Genom Atlası, https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga bulunan, veri sıralama için11. Taze bir operatif numune…

Representative Results

Bu yöntem, beyin tümörlerinde sürekli olarak aşağı teregüle edilen ve özellikle nöronal farklılaşma sırasında(Şekil 1)birlikte ifade edilen ve daha sonra tümör sağkalım yanıtında yer alan üç miRNA’dan oluşan bir modülün karakterizasyonuna olanak sağladı. tedavi (Şekil 2). Bu karmaşık bir onkojenik kromatin baskıcı yolu düzenleyerek gerçekleştirilir. Bu ko-ifade deseni bu üç miRNA arasında g?…

Discussion

Bu protokol, miRNA’ların izole olarak çalışmak yerine, biyolojik olarak gruplar halinde çalışarak ilgili olduğu ve bu grupların transkripsiyon olarak belirli hücresel bağlamlar tarafından belirlendiği fikrine dayanmaktadır26. Bu yaklaşımı çevirisel açıdan haklı göstermek için, hücrelerde/dokularda bu çoklu miRNA deseninin rekreasyonuna olanak tanıyan bir takip protokolü getirilmiştir. Bu miRNA’ların nispeten basit biyogenezinden yararlanarak mümkündür, böylece kara…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar destek ve yapıcı eleştiri için Harvey Cushing Nöro Onkoloji Laboratuvarı üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS tarafından desteklenmiştir K12NS80223 ve K08NS101091 P. P.

Materials

0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5-mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

References

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

View Video