Описан описано здесь протокол для характеристики модулей биологически синергетических miRNAs и их сборки в короткие трансгены, что позволяет одновременно переэкспрессии для применения генной терапии.
Биологическое значение микроРНК (миРНК) в здоровье и болезни в значительной степени зависит от конкретных комбинаций многих одновременно дерегулированных миРНК, а не на действие одной миРНК. Характеристика этих конкретных модулей miRNAs является фундаментальным шагом в максимизации их использования в терапии. Это чрезвычайно актуально, потому что их комбинаторные атрибуты могут быть практически использованы. Описано здесь метод определения конкретной подписи miRNA, относящейся к контролю онкогенных хроматиновых репрессоров при глиобластоме. Подход сначала определяет общую группу miRNAs, которые дерегулированы в опухолях по сравнению с нормальной ткани. Анализ дополнительно уточняется дифференциальными условиями культуры, подчеркивая подгруппу миРНК, которые одновременно выражаются в конкретных клеточных состояниях. Наконец, miRNAs, которые удовлетворяют эти фильтры объединяются в искусственные полицистронные трансгены, которая основана на эшафот естественно существующих генов miRNA кластеров, а затем используется для переэкспрессии этих модулей miRNA в принимающих клеток.
miRNAs предлагают непревзойденную возможность для развития широкого подхода генной терапии ко многим заболеваниям1,2,3,включая рак4,5. Это основано на нескольких уникальных особенностей этих биологических молекул, в том числе их небольшой размер6,простой биогенез7, и естественная тенденция к функции в ассоциации8. Многие заболевания характеризуются специфическими шаблонами выражения миРНК, которые часто сходятся на регуляции сложных биологических функций9. Цель этого метода заключается в том, чтобы сначала определить стратегию для выявления групп miRNAs, которые синергетически актуальны для конкретных клеточных функций. Следовательно, в нем обеспечивается стратегия восстановления таких комбинаций miRNA в исследованиях и приложениях ниже по течению.
Этот метод позволяет осуществлять функциональный анализ нескольких миРНК одновременно, используя их одновременное таргетирование большого количества мРНК, тем самым подизнося сложные ландшафты болезней. Этот подход был недавно использован для определения группы из трех miRNAs, что 1) одновременно downregulated в рак мозга и 2) показать сильную модель совместного выражения во время нервной дифференциации, а также в ответ на генотоксический стресс от радиации или Агент алкилирования ДНК. Комбинаторный повторное выражение этого модуля из трех miRNAs метод кластеризации описано ниже приводит к глубокому вмешательству в биологии раковых клеток и может быть легко использован в качестве стратегии генной терапии для доклинических исследований10. Этот протокол может представлять особый интерес для тех, кто участвует в исследованиях miRNA и его трансляционных приложениях.
Этот протокол основан на том, что вместо того, чтобы функционировать в изоляции, miRNAs биологически актуальны, работая в группах, и эти группы транскрипционно определяются конкретными клеточными контекстами26. Для обоснования такого подхода с точки зрения перевода вводится ?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить членов Лаборатории нейроонкологии Харви Кушинга за поддержку и конструктивную критику. Эта работа была поддержана NINDS гранты K12NS80223 и K08NS101091.
0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |