Summary

Характеристика функционально связанных miRNAs в глиобластоме и их инженерии в искусственные кластеры для генной терапии

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Описан описано здесь протокол для характеристики модулей биологически синергетических miRNAs и их сборки в короткие трансгены, что позволяет одновременно переэкспрессии для применения генной терапии.

Abstract

Биологическое значение микроРНК (миРНК) в здоровье и болезни в значительной степени зависит от конкретных комбинаций многих одновременно дерегулированных миРНК, а не на действие одной миРНК. Характеристика этих конкретных модулей miRNAs является фундаментальным шагом в максимизации их использования в терапии. Это чрезвычайно актуально, потому что их комбинаторные атрибуты могут быть практически использованы. Описано здесь метод определения конкретной подписи miRNA, относящейся к контролю онкогенных хроматиновых репрессоров при глиобластоме. Подход сначала определяет общую группу miRNAs, которые дерегулированы в опухолях по сравнению с нормальной ткани. Анализ дополнительно уточняется дифференциальными условиями культуры, подчеркивая подгруппу миРНК, которые одновременно выражаются в конкретных клеточных состояниях. Наконец, miRNAs, которые удовлетворяют эти фильтры объединяются в искусственные полицистронные трансгены, которая основана на эшафот естественно существующих генов miRNA кластеров, а затем используется для переэкспрессии этих модулей miRNA в принимающих клеток.

Introduction

miRNAs предлагают непревзойденную возможность для развития широкого подхода генной терапии ко многим заболеваниям1,2,3,включая рак4,5. Это основано на нескольких уникальных особенностей этих биологических молекул, в том числе их небольшой размер6,простой биогенез7, и естественная тенденция к функции в ассоциации8. Многие заболевания характеризуются специфическими шаблонами выражения миРНК, которые часто сходятся на регуляции сложных биологических функций9. Цель этого метода заключается в том, чтобы сначала определить стратегию для выявления групп miRNAs, которые синергетически актуальны для конкретных клеточных функций. Следовательно, в нем обеспечивается стратегия восстановления таких комбинаций miRNA в исследованиях и приложениях ниже по течению.

Этот метод позволяет осуществлять функциональный анализ нескольких миРНК одновременно, используя их одновременное таргетирование большого количества мРНК, тем самым подизнося сложные ландшафты болезней. Этот подход был недавно использован для определения группы из трех miRNAs, что 1) одновременно downregulated в рак мозга и 2) показать сильную модель совместного выражения во время нервной дифференциации, а также в ответ на генотоксический стресс от радиации или Агент алкилирования ДНК. Комбинаторный повторное выражение этого модуля из трех miRNAs метод кластеризации описано ниже приводит к глубокому вмешательству в биологии раковых клеток и может быть легко использован в качестве стратегии генной терапии для доклинических исследований10. Этот протокол может представлять особый интерес для тех, кто участвует в исследованиях miRNA и его трансляционных приложениях.

Protocol

1. Характеристика функционально связанных miRNAs в Глиобластоме Анализ широкого дифференциального выражения miRNA при глиобластоме по сравнению с мозгом Во-первых, определить наиболее существенно дерегулированных miRNAs в опухоли. Это может быть достигнуто с помощью по кр…

Representative Results

Этот метод позволил характеристику модуля из трех miRNAs, которые последовательно downregulated в опухолях головного мозга, которые совместно выражены специально во время дифференциации нейронов (Рисунок 1) и участвует в реакции выживания опухоли после терапи?…

Discussion

Этот протокол основан на том, что вместо того, чтобы функционировать в изоляции, miRNAs биологически актуальны, работая в группах, и эти группы транскрипционно определяются конкретными клеточными контекстами26. Для обоснования такого подхода с точки зрения перевода вводится ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить членов Лаборатории нейроонкологии Харви Кушинга за поддержку и конструктивную критику. Эта работа была поддержана NINDS гранты K12NS80223 и K08NS101091.

Materials

0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5-mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

References

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

View Video