神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付けと遺伝子治療のための人工クラスターへの工学
Summary
ここで説明する、生物学的に相乗的なmiRNAとその組み立てモジュールを短いトランス遺伝子に特徴付けるプロトコルであり、遺伝子治療用途に対する同時過剰発現を可能にする。
Abstract
健康および疾患におけるマイクロRNA(miRNA)の生物学的関連性は、単一のmiRNAの作用ではなく、多くの同時に規制緩和されたmiRNAの特定の組み合わせに大きく依存する。これらの特定のmiRNAモジュールの特徴付けは療法の使用を最大にする基本的なステップである。組み合わせ属性が実質的に悪用される可能性があるため、これは非常に重要です。ここで説明する、神経膠芽腫における発癌性クロマチン抑制剤の制御に関連する特定のmiRNAシグネチャを定義する方法である。このアプローチは、最初に正常組織と比較して腫瘍で調節解除されるmiRNAの一般的なグループを定義する。分析は、差動培養条件によってさらに洗練され、特定の細胞状態の間に同時に発現されるmiRNAのサブグループを強調する。最後に、これらのフィルタを満たすmiRNAは、自然に存在するmiRNAクラスター遺伝子の足場に基づく人工ポリシストロントランス遺伝子に結合され、これらのmiRNAモジュールを受け取る細胞に過剰発現するために使用されます。
Introduction
miRNAは、がん4、5を含む多くの疾患1、2、3に対する広範な遺伝子治療アプローチの開発のための比類のない機会を提供する。これは、これらの生体分子のいくつかのユニークな特徴に基づいており、その小さいサイズ6、単純な生体発生7、および関連8で機能する自然な傾向を含む。多くの疾患は、しばしば複雑な生物学的機能の調節に収束する特定のmiRNA発現パターンによって特徴付けされる9.この方法の目的は、最初に特定の細胞機能に相乗的に関連するmiRNAのグループを識別する戦略を定義することです。その結果、下流の研究および応用におけるこのようなmiRNA組み合わせの再確立のための戦略を提供する。
この方法により、複数のmiRNAの機能解析を一度に行い、多数のmRNAを同時に標的化し、疾患の複雑な景観を再現することができます。このアプローチは、最近、1)脳癌で同時に制御され、2)放射線による無毒性ストレスに応答する神経分化中に強い共発パターンを示す3つのmiRNAのグループを定義するために採用されている。DNAアルキル化剤以下に説明するクラスタリング法による3つのmiRNAのこのモジュールの組み合わせ再発現は、癌細胞の生物学に対する深い干渉をもたらすものであり、前臨床研究10の遺伝子治療戦略として容易に使用することができる。このプロトコルは、miRNA研究およびその翻訳アプリケーションに関与する人々に特に関心があるかもしれません。
Protocol
1. 神経膠芽腫における機能的関連miRNAの特徴付け 神経膠芽腫対脳における広い差分miRNA発現の解析 まず、腫瘍内で最も著しく緩和されたmiRNAを決定する。これは、少なくとも 3 つの異なる方法を使用して実現できます。 https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcgaで見つかったがんゲノムアトラスを採掘し、データ11をシー…
Representative Results
この方法は、脳腫瘍において一貫してダウンレギュレーションされている3つのmiRNAのモジュールの特徴付けを可能にし、これは神経分化(図1)の間に特異的に発現され、その後の腫瘍生存応答に関与するセラピー(図2)。これは、複雑な発発性クロマチン抑圧経路を調節することによって達成される。この共発現パターンは、?…
Discussion
このプロトコルは、単独で機能するのではなく、miRNAがグループで働くことによって生物学的に関連するという概念に基づいており、これらのグループは、特定の細胞コンテキスト26によって転写的に決定される。翻訳の観点からこのアプローチを正当化するために、細胞/組織におけるこのマルチmiRNAパターンの再構成を可能にするフォローアッププロトコルが導入される。…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ハーヴェイ・クッシング神経腫瘍学研究所のメンバーに対し、支援と建設的な批判に感謝したいと考えています。この作業は、NINDS助成金K12NS80223およびK08NS101091によってP.Pにサポートされました。
Materials
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).