Summary

Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le Glioblastoma et leur ingénierie en grappes artificielles pour la thérapie génique

Published: October 04, 2019
doi:

Summary

Décrit ici est un protocole pour caractériser des modules des miRNAs biologiquement synergiques et de leur assemblage en transgènes courts, qui permet la surexpression simultanée pour des applications de thérapie génique.

Abstract

La pertinence biologique des microARN (miARN) dans la santé et la maladie repose de manière significative sur des combinaisons spécifiques de nombreux miARN simultanément déréglementés plutôt que l’action d’un seul miRNA. La caractérisation de ces modules miRNAs spécifiques est une étape fondamentale dans la maximisation de leur utilisation en thérapie. Ceci est extrêmement pertinent parce que leurs attributs combinatoires peuvent être pratiquement exploités. Décrit ici est une méthode pour définir une signature spécifique de miRNA pertinente au contrôle des répresseurs oncogènes de chromatine dans le glioblastoma. L’approche définit d’abord un groupe général de miARN qui sont déréglementés dans les tumeurs par rapport au tissu normal. L’analyse est encore affinée par des conditions de culture différentielles, soulignant un sous-groupe de miARN qui sont co-exprimés simultanément au cours d’états cellulaires spécifiques. Enfin, les miARN qui satisfont ces filtres sont combinés en un transgène polycistronique artificiel, qui est basé sur un échafaudage de gènes de grappes de miARN naturellement existants, puis utilisés pour la surexpression de ces modules miRNA dans les cellules réceptrices.

Introduction

miRNAs offrent une occasion inégalée pour le développement d’une approche de thérapie génique large à de nombreuses maladies1,2,3, y compris le cancer4,5. Ceci est basé sur plusieurs caractéristiques uniques de ces molécules biologiques, y compris leur petite taille6, biogenèse simple7, et la tendance naturelle à fonctionner en association8. Beaucoup de maladies sont caractérisées par des modèles spécifiques d’expression miRNA, qui convergent souvent vers la régulation des fonctions biologiques complexes9. Le but de cette méthode est d’abord de définir une stratégie pour identifier les groupes de miARN qui sont synergiquement pertinents pour des fonctions cellulaires spécifiques. Par conséquent, il fournit une stratégie pour le rétablissement de ces combinaisons miRNA dans les études et les applications en aval.

Cette méthode permet l’analyse fonctionnelle de plusieurs miARN à la fois, en s’appuyant sur leur ciblage simultané d’un grand nombre de MARN, récapitulant ainsi les paysages complexes des maladies. Cette approche a été récemment employée pour définir un groupe de trois miRNAs que 1) sont simultanément downregulated dans le cancer du cerveau et 2) montrent un modèle fort de co-expression pendant la différenciation neurale aussi bien qu’en réponse au stress génotoxique par rayonnement ou un Agent alkylating d’ADN. La réexpression combinatoire de ce module de trois miARN par la méthode de regroupement décrite ci-dessous entraîne une interférence profonde avec la biologie des cellules cancéreuses et peut être facilement utilisée comme stratégie de thérapie génique pour les études précliniques10. Ce protocole peut être particulièrement intéressant pour ceux qui participent à la recherche miRNA et à ses applications translationnelles.

Protocol

1. Caractérisation des miARN fonctionnellement associés dans le glioblastome Analyse de l’expression de miRNA différentiel large dans le glioblastoma contre le cerveau Tout d’abord, déterminer les miARN les plus significativement déréglementés dans la tumeur. Cela peut être réalisé en utilisant au moins trois méthodes différentes: Mine the Cancer Genome Atlas, trouvé à https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, pour le s?…

Representative Results

Cette méthode a permis la caractérisation d’un module de trois miRNAs qui sont uniformément downregulated dans les tumeurs cérébrales, qui sont co-exprimées spécifiquement pendant la différenciation neuronale (figure 1) et impliquées dans la réponse de survie de tumeur après thérapie (Figure 2). Ceci est accompli en régulant une voie répressive oncogène complexe de chromatine. Ce modèle de coexpression suggérait …

Discussion

Ce protocole est basé sur l’idée que plutôt que de fonctionner isolément, les miARN sont biologiquement pertinents en travaillant en groupes, et ces groupes sont transcriptionnellement déterminés par des contextes cellulaires spécifiques26. Pour justifier cette approche d’un point de vue translationnel, un protocole de suivi qui permet de recréper ce modèle multi-miRNA dans les cellules/tissus est introduit. Ceci est possible en profitant de la biogenèse relativement simple des miRNAs, p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du Laboratoire de neuro-oncologie Harvey Cushing pour leur soutien et leurs critiques constructives. Ce travail a été soutenu par les subventions NINDS K12NS80223 et K08NS101091 à P. P.

Materials

0.4% low melting temperature agarose  IBI Scientific IB70058
0.45 µM sterile filter unit Merck Millipore SLH033RS
1.5-mL Microcentrifuge tube Eppendorf 22431081
6-Well plates  Greiner Bio-One 657160
Athymic mice (FoxN1 nu/nu) Envigo 069(nu)/070(nu/+)
B-27 Supplement  Thermo Fisher Scientific 12587010
Cell culture flask Greiner Bio-One 660175
Cell Scraper, 16cm Sarstedt 83.1832
Cesium 137 irradiator  JL Sheperd and Associates Core Facility (Harvard Medical School)
Chloroform Sigma-Aldrich 439142-4L
DMEM, high glucose, pyruvate  Thermo Fisher Scientific 11995040
Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Gibco 14190144
Eosin Y solution  Sigma-Aldrich E4009
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F9665
Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific 35050061
HEK-293 American Type Culture Collecti ATCC CRL-1573
Hematoxylin solution Sigma-Aldrich 1051750500
Human primary glioma stem-like cells (GBM62) Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Human primary glioma stem-like cells (MGG4) Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA)
Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP System Biosciences CD511B-1
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher Scientific 11668019
Microcentrifuge refrigerated Eppendorf model no. 5424 R, cat. no.5404000138
Mounting medium  Thermo Fisher Scientific 4112APG
Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes  Thermo Fisher Scientific  3117-0380PK
NanoDrop Thermo Fisher Scientific 2000c
Neural Progenitor cells (NPC) Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA)
Neurobasal Medium  Thermo Fisher Scientific 21103049
Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system Nikon, Japan 14314
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 31985088
PCR tubes  Sigma-Aldrich CLS6571-960EA
Penicillin-Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri-Dishes 94/16  Greiner Bio-One 632180
Poly-D-Lysine  Sigma- Aldrich P4707
Recombinant Human EGF  PeproTech  AF-100-15
Recombinant Human FGF-basic  PeproTech  AF-100-18B
Retinoic acid Gibco 12587-010 
RNA Miniprep Kit Direct-zol R2050
S1000 Thermal Cycler  Bio-Rad 1852196
Small Animal Image-Guided Micro Irradiator  Xstrahal Life Sciences, UK Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA)
Sorvall WX+ Ultracentrifuge  Thermo Fisher Scientific  75000100
StemPro Accutase  Thermo Fisher Scientific A1110501
StepOne Real-Time PCR System Applied Biosystems  4376357
SterilGARD biosafety cabinet  The Baker Company SG403A-HE
Sucrose Sigma-Aldrich S9378
T98-G American Type Culture Collecti ATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific 4366596
TaqMan Universal PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4324018
Temozolomide Tocris Bioscience 2706
Tissue-Tek optimum cutting temperature  Fisher Scientific NC9636948
TRIzol Reagent  Thermo Fisher Scientific 15596026 Lysis reagent
U251-MG American Type Culture Collecti ATCC HTB-17
U87-MG  American Type Culture Collecti ATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system  Thermo Fisher Scientific K4970-00
Water, HPLC grade Fisher W54
Xylene  Sigma-Aldrich 534056

References

  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bhaskaran, V., Peruzzi, P. Characterization of Functionally Associated miRNAs in Glioblastoma and their Engineering into Artificial Clusters for Gene Therapy. J. Vis. Exp. (152), e60215, doi:10.3791/60215 (2019).

View Video