Caracterização de miRNAs funcionalmente associadas em glioblastoma e sua engenharia em clusters artificiais para terapia gênica
Summary
É descrito aqui um protocolo para caracterizar os módulos de miRNAs biologicamente sinérgica e seu conjunto em transgenes curtos, que permite o superexpressão simultâneo para aplicações da terapia de Gene.
Abstract
A relevância biológica de microRNAs (miRNAs) na saúde e na doença depende significativamente de combinações específicas de muitos miRNAs desregulados simultaneamente ao invés da ação de um único miRNA. A caracterização desses módulos miRNAs específicos é um passo fundamental para maximizar seu uso na terapia. Isso é extremamente relevante porque seus atributos combinatoriais podem ser praticamente explorados. É descrito aqui um método para definir uma assinatura específica de Mirna relevante ao controle de repressores oncogênico do cromatina no glioblastoma. A aproximação define primeiramente um grupo geral de miRNAs que são desegulated nos tumores em comparação ao tecido normal. A análise é ainda mais refinada por condições de cultura diferencial, ressaltando um subgrupo de miRNAs que são coexpressos simultaneamente durante Estados celulares específicos. Finalmente, os miRNAs que satisfazem estes filtros são combinados em um transgenes polycistronic artificiais, que seja baseado em um andaime de genes naturalmente existentes dos conjuntos de Mirna, usado então para o superexpressão destes módulos de Mirna em pilhas de recepção.
Introduction
miRNAs oferecer uma oportunidade ímpar para o desenvolvimento de uma abordagem de terapia gênica ampla para muitas doenças1,2,3, incluindoo cancro4,5. Isto é baseado em diversas características originais destas moléculas biológicas, incluindo seu tamanho pequeno6, biogênese simples7, e tendência natural funcionar na associação8. Muitas doenças são caracterizadas por padrões específicos de expressão de miRNA, que muitas vezes convergem para a regulação de funções biológicas complexas9. O objetivo deste método é primeiro definir uma estratégia para identificar grupos de miRNAs que são sinergicamente relevantes para funções celulares específicas. Consequentemente, fornece uma estratégia para o restabelecimento de tais combinações de miRNA em estudos e aplicações a jusante.
Este método permite a análise funcional de vários miRNAs de uma só vez, aproveitando a sua segmentação simultânea de um grande número de mRNAs, recapitulando assim as paisagens complexas de doenças. Esta abordagem tem sido recentemente empregada para definir um grupo de três miRNAs que 1) são simultaneamente desregulado no cancro do cérebro e 2) mostram um forte padrão de coexpressão durante a diferenciação neural, bem como em resposta ao stress genotóxico por radiação ou um Agente alquilantes do ADN. A reexpressão combinatória deste módulo de três miRNAs pelo método de agrupamento descrito abaixo resulta em profunda interferência com a biologia das células cancerosas e pode ser facilmente utilizada como estratégia de terapia gênica para estudos pré-clínicos10. Este protocolo pode ser de particular interesse para os envolvidos na pesquisa de miRNA e suas aplicações translacionais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo baseia-se na noção de que, em vez de funcionar isoladamente, os miRNAs são biologicamente relevantes por trabalharem em grupos, e esses grupos são determinados transcripcionalmente por contextos celulares específicos26. Para justificar essa abordagem a partir de uma perspectiva translacional, um protocolo de acompanhamento que permite a recriação deste padrão de multi-miRNA em células/tecidos é introduzido. Isto é possível aproveitando-se da biosgênese relativamente sim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer aos membros do laboratório de Oncologia neuro de Harvey Cushing por apoio e críticas construtivas. Este trabalho foi apoiado pelo NINDS concede K12NS80223 e K08NS101091 a P. P.
Materials
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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