Charakterisierung von funktional assoziierten miRNAs in Glioblastom und deren Engineering in künstliche Cluster für die Gentherapie
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Charakterisierung von Modulen biologisch synergistischer miRNAs und deren Montage in kurze Transgene beschrieben, das eine gleichzeitige Überexpression für Gentherapieanwendungen ermöglicht.
Abstract
Die biologische Relevanz von microRNAs (miRNAs) in Gesundheit und Krankheit hängt signifikant von spezifischen Kombinationen vieler gleichzeitig deregulierter miRNAs ab und nicht von der Wirkung einer einzelnen miRNA. Die Charakterisierung dieser spezifischen miRNAs-Module ist ein grundlegender Schritt zur Maximierung ihrer Anwendung in der Therapie. Dies ist äußerst relevant, da ihre kombinatorischen Eigenschaften praktisch ausgenutzt werden können. Hier wird eine Methode beschrieben, um eine spezifische miRNA-Signatur zu definieren, die für die Kontrolle von onkogenen Chromatin-Repressoren bei Glioblastom relevant ist. Der Ansatz definiert zunächst eine allgemeine Gruppe von miRNAs, die bei Tumoren im Vergleich zu normalem Gewebe dereguliert werden. Die Analyse wird durch differenzielle Kulturbedingungen weiter verfeinert, was eine Untergruppe von miRNAs unterstreicht, die gleichzeitig während bestimmter Zellzustände mitexprimiert werden. Schließlich werden die miRNAs, die diese Filter zufriedenstellen, zu einem künstlichen polycistronischen Transgenes kombiniert, das auf einem Gerüst natürlich vorhandener miRNA-Clustergene basiert und dann zur Überexpression dieser miRNA-Module in empfangende Zellen verwendet wird.
Introduction
miRNAs bieten eine unübertroffene Möglichkeit für die Entwicklung eines breiten Gentherapie-Ansatzes für viele Krankheiten1,2,3, einschließlich Krebs4,5. Dies basiert auf mehreren einzigartigen Merkmalen dieser biologischen Moleküle, einschließlich ihrer kleinen Größe6, einfache Biogenese7, und natürliche Tendenz, in Assoziation zu funktionieren8. Viele Krankheiten sind durch spezifische miRNA-Expressionsmuster gekennzeichnet, die oft auf die Regulierung komplexer biologischer Funktionen konvergieren9. Der Zweck dieser Methode ist zunächst eine Strategie zu definieren, um Gruppen von miRNAs zu identifizieren, die synergistisch relevant für bestimmte zelluläre Funktionen sind. Folglich bietet sie eine Strategie für die Wiederherstellung solcher miRNA-Kombinationen in nachgelagerten Studien und Anwendungen.
Diese Methode ermöglicht die funktionelle Analyse mehrerer miRNAs auf einmal, indem sie ihre gleichzeitige Ausrichtung auf eine große Anzahl von mRNAs nutzt und so die komplexen Landschaften von Krankheiten rekapituliert. Dieser Ansatz wurde vor kurzem verwendet, um eine Gruppe von drei miRNAs zu definieren, die 1) gleichzeitig bei Hirntumor enregulierung sind und 2) ein starkes Ko-Expressionsmuster während der neuronalen Differenzierung sowie als Reaktion auf genotoxischen Stress durch Strahlung oder DNA-Alkylierungsmittel. Die kombinatorische Reexpression dieses Moduls von drei miRNAs durch die unten beschriebene Clustering-Methode führt zu tiefgreifenden Eingriffen in die Biologie von Krebszellen und kann leicht als Gentherapiestrategie für präklinische Studien verwendet werden10. Dieses Protokoll kann für diejenigen von besonderem Interesse sein, die an der miRNA-Forschung und ihren translationalen Anwendungen beteiligt sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll basiert auf der Vorstellung, dass miRNAs, anstatt isoliert zu funktionieren, biologisch relevant sind, indem sie in Gruppen arbeiten, und diese Gruppen werden transkriptionsweise durch spezifische zelluläre Kontexte bestimmt26. Um diesen Ansatz aus einer translationalen Perspektive zu rechtfertigen, wird ein Follow-up-Protokoll eingeführt, das die Nachbildung dieses Multi-miRNA-Musters in Zellen/Geweben ermöglicht. Dies ist möglich durch die relativ einfache Biogenese von miRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei den Mitgliedern des Harvey Cushing Neuro Oncology Laboratory für die Unterstützung und konstruktive Kritik. Diese Arbeit wurde durch die NINDS-Zuschüsse K12NS80223 und K08NS101091 an P. P. unterstützt.
Materials
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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