אפיון של miRNAs הקשורים פונקציונלית ב גלינובלסטומה וההנדסה שלהם לאשכולות מלאכותיים עבור טיפול גנטי
Summary
המתואר כאן הוא פרוטוקול לאפיון מודולים של miRNAs ביולוגית מירסטים וההרכבה שלהם לתוך טרנסגנים קצרים, אשר מאפשר ביטוי יתר בו של טיפול גנטי יישומים.
Abstract
הרלוונטיות הביולוגית של microRNAs (miRNAs) בבריאות ובמחלות מסתמך באופן משמעותי על שילובים ספציפיים של מירנאס רבים בו בו במקום הפעולה של Mirnas יחיד. האפיון של אלה מודולים miRNAs ספציפיים הוא צעד בסיסי למקסם את השימוש בהם בטיפול. זה רלוונטי מאוד כי התכונות הקומבינטורית שלהם יכול להיות מנוצל כמעט. המתואר כאן היא שיטה להגדיר חתימה ספציפית miRNA רלוונטי השליטה של כרומטין repressors הכרומטוגניים ב glioblastoma. הגישה הראשונה מגדירה קבוצה כללית של miRNAs כי הם הפונים בגידולים בהשוואה לרקמות נורמלי. הניתוח מעודן עוד יותר על-ידי תנאי תרבות דיפרנציאלים, והבקיע קבוצת משנה של miRNAs אשר מבוטאים בו במהלך מדינות סלולר ספציפיות. בסופו של דבר, miRNAs כי לספק מסננים אלה משולבים לתוך הטרנסגנים מלאכותיים polycistronic, אשר מבוסס על פיגום של הגנים הקיימים מירונה אשכולות, לאחר מכן משמש ביטוי יתר של אלה מודולים Mirnas לתוך מקבל תאים.
Introduction
mirnas מציעים הזדמנות ללא תחרות לפיתוח של גישה טיפולית רחבה למחלות רבות1,2,3, כולל סרטן4,5. זה מבוסס על מספר תכונות ייחודיות של מולקולות ביולוגיות אלה, כולל גודל קטן שלהם6, biogenesis פשוט7, ונטייה טבעית לתפקד באסוציאציה8. מחלות רבות מתאפיינות בביטויים ספציפיים של ביטוי miRNA, אשר לעתים קרובות להתכנס על התקנה של פונקציות ביולוגיות מורכבות9. מטרת שיטה זו היא הראשונה להגדיר אסטרטגיה כדי לזהות קבוצות של miRNAs הקשורים בסינרגיה לפונקציות סלולריות ספציפיות. כתוצאה מכך, הוא מספק אסטרטגיה להקמת מחדש של שילובים כאלה של miRNA במחקרים ויישומים במורד הזרם.
שיטה זו מאפשרת ניתוח פונקציונלי של miRNAs מרובים בבת אחת, מינוף על המיקוד הסימולטני שלהם של מספר רב של mRNAs, ובכך ללכוד את הנופים המורכבים של מחלות. גישה זו הועסק לאחרונה כדי להגדיר קבוצה של שלושה miRNAs כי 1) הם בו מוסתות בו בסרטן המוח 2) להראות דפוס חזק ביטוי שיתוף במהלך בידול עצבי, כמו גם בתגובה ללחץ גנוטוקסיידי קרינה או . סוכן די. אנ. איי קומבינטורית re-ביטוי של מודול זה של שלושה miRNAs על ידי שיטת האשכול המתואר להלן תוצאות הפרעה עמוקה עם הביולוגיה של תאים סרטניים ניתן להשתמש בקלות כאסטרטגיה ריפוי גנטי למחקרים פרה-קליניים10. פרוטוקול זה עשוי להיות מעניין במיוחד לאלה המעורבים במחקר miRNA ויישומים הטרנסלבותית שלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מבוסס על הרעיון כי במקום לתפקד בבידוד, miRNAs הם רלוונטיים ביולוגית על ידי עבודה בקבוצות, וקבוצות אלה נקבעים באמצעות ההקשרים הסלולריים הספציפיים26. כדי להצדיק גישה זו מנקודת מבט טרנסלתית, פרוטוקול המשך טיפול המאפשר בילוי של דפוס זה multi-miRNA בתאים/רקמות הוא הציג. זה אפשר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לחברי המעבדה הארווי קושינג נוירו אונקולוגיה לתמיכה וביקורת בונה. עבודה זו נתמכת על ידי NINDS מענקים K12NS80223 ו K08NS101091 ל P. P.
Materials
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5-mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer’s Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell’Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26 (2011).
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
