Studio funzionale in vivo sulle varianti umane rare associate alla malattia utilizzando la Drosophila

I pazienti con malattie rare spesso subiscono un viaggio arduo indicato come “odissea diagnostica” per ottenere una diagnosi accurata¹. Si ritiene che la maggior parte delle malattie rare abbia una forte origine genetica, rendendo critici gli elementi critici dell’elaborazione genetica/genomica dell’elaborazione clinica. Oltre all’analisi delle variazioni dei pannelli genici e dei numeri di copie candidati, oltre all’analisi delle variazioni dei numeri cromosomici, all’intero esoma (WES) e al sequenziamento dell’intero genoma sono diventati strumenti sempre più preziosi nell’ultimo decennio^{2, 3}. Attualmente, il tasso diagnostico per identificare una variante patogena nota in WES e WGS è di 25% (superiore nei casi pediatrici)^4,5. Per la maggior parte dei casi che rimangono non diagnosticati dopo WES/WGS clinici, un problema comune è che ci sono molti geni e varianti candidati. Il sequenziamento di nuova generazione spesso identifica varianti nuove o ultrarare in molti geni e interpretare se queste varianti contribuiscono ai fenotipi della malattia è difficile. Ad esempio, anche se la maggior parte delle mutazioni senza senso o frameshift nei geni sono ritenute come alleli di perdita di funzione (LOF) a causa del decadimento mediato da sciocchezze della trascrizione codificata, mutazioni troncanti trovate negli ultimi esoni sfuggono a questo processo e possono funzionare come benigni o gain-of-function (GOF) alleli⁶.

Inoltre, prevedere gli effetti di un allele missense è un compito scoraggiante, dal momento che può portare a una serie di diversi scenari genetici come descritto per la prima volta da Herman Muller negli anni ’30 (cioè amorfi, ipomorfi, ipomorfi, antimorfi, antimorfi, neomorfi o isomorfi)⁷ . Numerosi programmi e metodologie in silico sono stati sviluppati per prevedere la patogenicità delle varianti missense basate sulla conservazione evolutiva, il tipo di cambiamento degli amminoacidi, la posizione all’interno di un dominio funzionale, la frequenza allele nella popolazione generale, e altri parametri⁸. Tuttavia, questi programmi non sono una soluzione completa per risolvere il complicato problema dell’interpretazione delle varianti. È interessante notare che, un recente studio ha dimostrato che cinque algoritmi di previsione della patogenicità variante ampiamente utilizzati (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) concordano sulla patogenicità 80% delle volte⁸ . In particolare, anche quando tutti gli algoritmi sono d’accordo, restituiscono una previsione errata della patogenicità fino all’11% del tempo. Questo non solo porta a un’interpretazione clinica imperfetta, ma può anche dissuadere i ricercatori dal seguire le nuove varianti elencandole falsamente come benigne. Un modo per completare l’attuale limitazione della modellazione in silico consiste nel fornire dati sperimentali che dimostrino l’effetto della funzione variant in vitro, ex vivo (ad esempio, cellule coltivate, organoidi) o in vivo.

Gli studi funzionali in vivo sulle varianti associate alle malattie rare nel MO hanno punti di forza unici¹³ e sono stati adottati da molte iniziative di ricerca sulle malattie rare in tutto il mondo, tra cui la Rete delle Malattie Non Diagnosi (UDN) negli Stati Uniti e Rara Malattie Modelli & Meccanismi (RDMM) Reti in Canada, Giappone, Europa e Australia¹⁴. Oltre a questi sforzi coordinati per integrare i ricercatori MO nel flusso di lavoro della diagnosi di malattie rare e degli studi meccanicistici su scala nazionale, una serie di studi di collaborazione individuale tra ricercatori clinici e MO hanno portato alla scoperta e caratterizzazione di molti nuovi geni e varianti che causano malattie umane^82,83,84.

Nell’UDN, un Centro di screening centralizzato degli organismi modello (MOSC) riceve la presentazione di geni e varianti candidati con una descrizione delle condizioni del paziente e valuta se la variante è probabilmente patogena utilizzando strumenti informatici e in vivo Esperimenti. Nella Fase I (2015-2018) dell’UDN, il MOSC comprendeva un Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] e il nucleo di pesce zebra (Università dell’Oregon) che ha lavorato in collaborazione per valutare i casi. Utilizzando l’analisi informatica e una serie di diverse strategie sperimentali in Drosophila e pesce zebra, il MOSC ha finora contribuito alla diagnosi di 132 pazienti, l’identificazione di 31 nuove sindromi⁵⁵, scoperta di diversi nuovi i geni della malattia (ad esempio, EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) e l’espansione fenotipica della malattia nota (ad esempio, CACNA1A²¹, ACOX1²²).

Oltre ai progetti all’interno dell’UDN, i ricercatori del MOSC Drosophila Core hanno contribuito a nuove scoperte geniche della malattia in collaborazione con i Centers for Mendelian Genomics e altre iniziative (ad esempio, ANKLE2²³, TM2D3 ^{24 ,} NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) utilizzando lo stesso insieme di informatica e genetica strategie sviluppate per l’UDN. Dato il significato degli studi di MO sulla diagnosi di malattia rara, il MOSC è stato ampliato per includere un C. elegans Core e un secondo nucleo di pesce zebra (entrambi alla Washington University di St. Louis) per la fase II (2018-2022) dell’UDN.

Questo manoscritto descrive un protocollo di studio funzionale in vivo che viene utilizzato attivamente nel nucleo di Drosophila UDN MOSC per determinare se le varianti missense hanno conseguenze funzionali sulla proteina di interesse utilizzando mosche transgeniche che esprimono l’uomo Proteine. L’obiettivo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori MO a lavorare in collaborazione con gruppi di ricerca clinica per fornire prove sperimentali che una variante candidata in un gene di interesse ha conseguenze funzionali, facilitando così la diagnosi clinica. Questo protocollo è particolarmente utile in uno scenario in cui un ricercatore della Drosophila viene avvicinato da un ricercatore clinico che ha un paziente a malattia rara con una variante candidata specifica in un gene di interesse.

Questo protocollo può essere suddiviso in tre elementi: (1) raccogliere informazioni per valutare la probabilità che la variante di interesse sia responsabile del fenotipo del paziente e la fattibilità di uno studio funzionale in Drosophila, (2) raccolta strumenti genetici esistenti e stabilirne di nuovi, e (3) svolgere studi funzionali in vivo. Il terzo elemento può essere ulteriormente suddiviso in due sottoelementi in base al modo in cui può essere valutata la funzione di una variante di interesse (esperimento di salvataggio o strategie basate su sovraespressioni). È importante notare che questo protocollo può essere adattato e ottimizzato a molti scenari al di fuori della ricerca sulle malattie monogeniche rare (ad esempio, malattie comuni, interazioni genetico-ambiente e schermi farmacologici/genetici per identificare gli obiettivi terapeutici). La capacità di determinare la funzionalità e la patogenicità delle varianti non solo gioverà al paziente di interesse fornendo una diagnosi molecolare accurata, ma avrà anche un impatto più ampio sulla ricerca scientifica traslazionale e di base.