In Vivo Funktionelle Studie von krankheitsassoziierten seltenen menschlichen Varianten mit Drosophila

Patienten mit seltenen Krankheiten unterziehen sich oft einer anstrengenden Reise, die als “diagnostische Odyssee” bezeichnet wird, um eine genaue Diagnose zu erhalten¹. Es wird angenommen, dass die meisten seltenen Krankheiten einen starken genetischen Ursprung haben, was genetische/genomische Analysen zu kritischen Elementen der klinischen Aufarbeitung macht. Neben der Sequenzierung von Kandidatengenpanels und der Variationsvariation von Kopierzahlen auf Basis von chromosomalen Mikroarrays sind Die Technologien für die Ganz-Exom-Sequenzierung (WES) und die Vollgenomsequenzierung (WGS) in den letzten^zehnJahren zu immer wertvolleren Werkzeugen geworden. ³. Derzeit liegt die diagnostische Rate zur Identifizierung einer bekannten pathogenen Variante in WES und WGS bei 25 % (höher in pädiatrischen Fällen)^4,5. In den meisten Fällen, die nach dem klinischen WES/WGS nicht diagnostiziert werden, ist ein häufiges Problem, dass es viele Kandidatengene und Varianten gibt. Die Sequenzierung der nächsten Generation identifiziert häufig neuartige oder ultraseltene Varianten in vielen Genen, und es ist eine Herausforderung, zu interpretieren, ob diese Varianten zu Krankheitsphänotypen beitragen. Obwohl beispielsweise die meisten Unsinn- oder Frameshift-Mutationen in Genen als Funktionsverlust -allele (LOF) aufgrund des unsinnig vermittelten Zerfalls des codierten Transkripts angesehen werden, entweichen abgeschnittene Mutationen, die in den letzten Exons gefunden wurden, diesem Prozess und können als gutartige oder Funktionsverstärkung (GOF) Allele⁶.

Darüber hinaus ist die Vorhersage der Auswirkungen eines Missense-Alleels eine gewaltige Aufgabe, da es zu einer Reihe verschiedener genetischer Szenarien führen kann, wie Sie erstmals von Herman Muller in den 1930er Jahren beschrieben wurden (d. h. amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph oder isomorph)⁷ . Zahlreiche Silico-Programme und -Methoden wurden entwickelt, um die Pathogenität von Missense-Varianten auf der Grundlage der evolutionären Konservierung, der Art der Aminosäureänderung, der Position innerhalb eines funktionellen Bereichs, der Allelhäufigkeit in der allgemeinen Bevölkerung vorherzusagen, und andere Parameter⁸. Diese Programme sind jedoch keine umfassende Lösung, um das komplizierte Problem der Varianteninterpretation zu lösen. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass fünf breit angelegte Varianten-Pathogenitätsvorhersagealgorithmen (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) sich auf Pathogenität von 80% der Zeit einigen 80% der Zeit⁸ . Bemerkenswert ist, dass selbst wenn alle Algorithmen zustimmen, sie eine falsche Vorhersage der Pathogenität bis zu 11% der Zeit zurückgeben. Dies führt nicht nur zu fehlerhaften klinischen Interpretation, sondern kann auch Forscher davon abhalten, neue Varianten zu verfolgen, indem sie sie fälschlicherweise als gutartig auflisten. Eine Möglichkeit, die aktuelle Beschränkung der Silico-Modellierung zu ergänzen, besteht darin, experimentelle Daten bereitzustellen, die die Wirkung der Variantenfunktion in vitro, ex vivo (z. B. kultivierte Zellen, Organoide) oder in vivo demonstrieren.

In vivo funktionelle Studien zu varianten seltenen Krankheiten in MO haben einzigartige Stärken¹³ und wurden von vielen Forschungsinitiativen für seltene Krankheiten auf der ganzen Welt übernommen, einschließlich des Undiagnosed Diseases Network (UDN) in den Vereinigten Staaten und Rare Krankheiten Modelle & Mechanismen (RDMM) Netzwerke in Kanada, Japan, Europa und Australien¹⁴. Zusätzlich zu diesen koordinierten Bemühungen, MO-Forscher in den Arbeitsablauf von Diagnosen seltener Krankheiten und mechanistischen Studien auf nationaler Ebene zu integrieren, haben eine Reihe individueller kollaborativer Studien zwischen klinischen und MO-Forschern zu der Entdeckung geführt. und Charakterisierung vieler neuer menschenkranker Gene und Varianten^82,83,84.

Im UDN erhält ein zentralisiertes Model Organisms Screening Center (MOSC) Einreichungen von Kandidatengenen und Varianten mit einer Beschreibung des Zustands des Patienten und beurteilt, ob die Variante mit Informatikwerkzeugen und in vivo pathogen sein dürfte. Experimente. In Phase I (2015-2018) des UDN bestand das MOSC aus einem Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] und Zebrafish Core (University of Oregon), das gemeinsam an der Beurteilung von Fällen arbeitete. Mit Hilfe der Informatikanalyse und einer Reihe verschiedener experimenteller Strategien in Drosophila und Zebrafischen hat das MOSC bisher zur Diagnose von 132 Patienten beigetragen, die Identifizierung von 31 neuen Syndromen⁵⁵, Entdeckung mehrerer neuer Krankheitsgene (z.B. EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) und phänotypische Ausdehnung bekannter Krankheiten Gene (z. B. CACNA1A²¹, ACOX1²²).

Zusätzlich zu den Projekten innerhalb des UDN haben MOSC Drosophila Core-Forscher in Zusammenarbeit mit den Centers for Mendelian Genomics und anderen Initiativen (z.B. ANKLE2²³, TM2D3) zu neuen Entdeckungen von Krankheitsgenen beigetragen. ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) mit dem gleichen Satz von Informatik und Genetik Strategien, die für die UDN entwickelt wurden. Angesichts der Bedeutung von MO-Studien zur Diagnose seltener Krankheiten wurde das MOSC um einen C. elegans Core und einen zweiten Zebrafischkern (beide an der Washington University in St. Louis) für Phase II (2018-2022) des UDN erweitert.

Dieses Manuskript beschreibt ein in vivo funktionelles Studienprotokoll, das aktiv im UDN MOSC Drosophila Core verwendet wird, um festzustellen, ob Missense-Varianten funktionelle Folgen für das Protein von Interesse haben, indem transgene Fliegen, die menschliche Proteine. Das Ziel dieses Protokolls ist es, MO-Forschern zu helfen, mit klinischen Forschungsgruppen zusammenzuarbeiten, um experimentelle Beweise dafür zu liefern, dass eine Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse funktionelle Folgen hat, wodurch die klinische Diagnose erleichtert wird. Dieses Protokoll ist am nützlichsten in einem Szenario, in dem ein Drosophila-Forscher von einem klinischen Forscher angesprochen wird, der einen Patienten mit einer seltenen Krankheit mit einer bestimmten Kandidatenvariante in einem Gen von Interesse hat.

Dieses Protokoll kann in drei Elemente unterteilt werden: (1) Sammeln von Informationen, um die Wahrscheinlichkeit zu beurteilen, dass die Variante des Interesses für den Patientenphänotyp verantwortlich ist, und die Durchführbarkeit einer funktionellen Studie in Drosophila, (2) bestehende genetische Instrumente und die Etablierung neuer Instrumente und (3) die Durchführung funktioneller Studien in vivo. Das dritte Element kann weiter in zwei Unterelemente unterteilt werden, je nach der Bewertung der Funktion einer Interessenvariante (Rettungsexperiment oder überexpressionbasierte Strategien). Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll an viele Szenarien außerhalb der Forschung an seltenen monogenen Krankheiten angepasst und optimiert werden kann (z. B. häufige Krankheiten, Gen-Umwelt-Wechselwirkungen und pharmakologische/genetische Screens zur Identifizierung therapeutischer Ziele). Die Fähigkeit, die Funktionalität und Pathogenität von Varianten zu bestimmen, wird nicht nur dem Patienten von Interesse durch eine genaue molekulare Diagnose nützen, sondern auch breitere Auswirkungen auf die translationale und wissenschaftliche Grundlagenforschung haben.