В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Пациенты с редкими заболеваниями часто проходят трудное путешествие называют “диагностическая одиссея”, чтобы получить точный диагноз¹. Большинство редких заболеваний, как полагают, имеют сильное генетическое происхождение, что делает генетический / геномный анализ критических элементов клинической работы. В дополнение к последовательности генной панели кандидата и анализа вариаций числа копий на основе хромосомных микроаррей, технологий секвенирования всего генома (WES) и секвенирования всего генома (WGS) стали все более ценными инструментами за последнее десятилетие^{2, 3}. В настоящее время, диагностическая ставка для выявления известных патогенных вариантов в WES и WGS составляет 25% (выше в детских случаях)^4,5. В большинстве случаев, которые остаются невыявленными после клинической WES/WGS, общая проблема заключается в том, что существует много генов и вариантов кандидатов. Секвенирование следующего поколения часто определяет новые или ультра-редкие варианты во многих генах, и интерпретация того, способствуют ли эти варианты фенотипам болезни, является сложной задачей. Например, хотя большинство ерунда или frameshift мутации в генах, как полагают, потеря функции (LOF) аллели из-за ерунды опосредованного распада закодированного транскрипта, усечение мутаций, найденных в последних экзонов избежать этого процесса и может функционировать как доброкачественные или прироста функций (GOF) аллели⁶.

Кроме того, прогнозирование последствий аллеля неправильного зрения является сложной задачей, так как это может привести к ряду различных генетических сценариев, как впервые описано Германом Мюллером в 1930-х (т.е. аморф, гипоморф, гиперморф, антиморф, неоморф, или изоморф)⁷ . Многочисленные программы силико и методологии были разработаны для прогнозирования патогенности вариантов неправильности, основанных на эволюционной сохранении, типами изменения аминокислот, положением в функциональной области, частотой аллелей в общей популяции, и другие параметры⁸. Однако эти программы не являются комплексным решением для решения сложной проблемы интерпретации вариантов. Интересно, что недавнее исследование показало, что пять широко используемых алгоритмов прогнозирования патогенности (Полифен⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Мутация Taster) согласны на патогенность 80% времени⁸ . Примечательно, что даже когда все алгоритмы согласны, они возвращают неправильное предсказание патогенности до 11% времени. Это не только приводит к недостаткам клинической интерпретации, но и может отговорить исследователей от последующих на новые варианты, ложно перечисляя их как доброкачественные. Один из способов дополнить нынешнее ограничение в силико моделирования является предоставление экспериментальных данных, которые демонстрируют эффект функции варианта in vitro, ex vivo (например, культивированные клетки, органоиды), или in vivo.

In vivo функциональные исследования редких вариантов заболеваний, связанных в MO имеют уникальные сильные¹³ и были приняты многими редкими инициативами исследования заболеваний по всему миру, в том числе Недиагностированные болезни сети (UDN) в Соединенных Штатах и редких Болезни Модели и механизмы (RDMM) Сети в Канаде, Японии, Европе и Австралии¹⁴. В дополнение к этим скоординированным усилиям по интеграции исследователей МО в рабочий процесс диагностики редких заболеваний и механистических исследований в национальном масштабе, ряд индивидуальных совместных исследований между клиническими и MO исследователей привели к открытию и характеристика многих новых генов и вариантов, вызывающих болезни человека,^82,83,84.

В UDN, централизованный модельНые органы скрининговый центр (MOSC) получает представления генов-кандидатов и вариантов с описанием состояния пациента и оценивает, является ли вариант может быть патогенным с помощью инструментов информатики и in vivo Эксперименты. В фазе I (2015-2018) UDN, MOSC состоит из Drosophila Core (Бейлор колледж медицины (BCM) и Зебрафиш ядро (Университет штата Орегон), которые работали совместно для оценки случаев. Используя анализ информатики и ряд различных экспериментальных стратегий в Drosophila и зебрафиш, MOSC до сих пор способствовали диагностике 132 пациентов, выявление 31 новых синдромов⁵⁵, открытие нескольких новых человеческих гены заболеваний (например, EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) и фенотипическое расширение известного заболевания гены (например, CACNA1A²¹,ACOX1²²).

В дополнение к проектам в рамках UDN, исследователи MOSC Drosophila Core внесли свой вклад в новые открытия генов болезни в сотрудничестве с Центрами менделианской геномики и другими инициативами (например, ANKLE2²³, TM2D3 ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) с использованием того же набора информатики и генетики стратегии, разработанные для UDN. Учитывая значение исследований МО по диагностике редких заболеваний, MOSC был расширен, чтобы включить ядро C. elegans и второе ядро зебрафиш (оба в Университете Вашингтона в Сент-Луисе) для фазы II (2018-2022) UDN.

Данная рукопись описывает протокол функционального исследования in vivo, который активно используется в UDN MOSC Drosophila Core, чтобы определить, имеют ли варианты неправильного зрения функциональные последствия для белка, интересуемого с помощью трансгенных мух, которые выражают человека Белки. Цель этого протокола состоит в том, чтобы помочь исследователям МО работать совместно с клиническими исследовательскими группами, чтобы предоставить экспериментальные доказательства того, что вариант кандидата в гене интереса имеет функциональные последствия, тем самым облегчая клиническую диагностику. Этот протокол является наиболее полезным в сценарии, в котором исследователь Drosophila подошел клинический исследователь, который имеет редкое заболевание пациента с конкретным вариантом кандидата в гене интереса.

Этот протокол может быть разбит на три элемента: (1) сбор информации для оценки вероятности варианта интереса, ответственного за фенотип пациента и осуществимость функционального исследования в Drosophila, (2) сбор существующих генетических инструментов и создания новых, и (3) выполнения функциональных исследований in vivo. Третий элемент можно также разделить на два подэлемента на основе того, как можно оценивать функцию варианта интереса (спасательный эксперимент или стратегии, основанные на перевыражении). Важно отметить, что этот протокол может быть адаптирован и оптимизирован для многих сценариев, не связанных с исследованиями редких моногенных заболеваний (например, распространенные заболевания, взаимодействие генно-экологических и фармакологических/генетических экранов для определения терапевтических целей). Способность определять функциональность и патогенность вариантов не только принесет пользу интересуемому пациенту, обеспечивая точную молекулярную диагностику, но и окажет более широкое влияние как на трансляционные, так и на фундаментальные научные исследования.