En Vivo Estudio Funcional de Variantes Humanas Raras Asociadas a la Enfermedad Usando Drosophila

Los pacientes con enfermedades raras a menudo se someten a un arduo viaje conocido como la “odisea diagnóstica” para obtener un diagnóstico preciso¹. Se cree que la mayoría de las enfermedades raras tienen un fuerte origen genético, lo que hace que los análisis genéticos/genómicos sean elementos críticos del estudio clínico. Además de la secuenciación de paneles genéticos candidatos y el análisis de variación de los números de copia basados en microarrays cromosómicos, las tecnologías de secuenciación de todo el exónmio (WES) y de secuenciación del genoma completo (WGS) se han convertido en herramientas cada vez más valiosas en la última década^{2, 3}. Actualmente, la tasa de diagnóstico para la identificación de una variante patógena conocida en WES y WGS es de 25% (mayor en casos pediátricos)^4,5. Para la mayoría de los casos que permanecen sin diagnosticar después del WES/WGS clínico, un problema común es que hay muchos genes y variantes candidatas. La secuenciación de próxima generación a menudo identifica variantes novedosas o ultra raras en muchos genes, y la interpretación de si estas variantes contribuyen a los fenotipos de la enfermedad es un reto. Por ejemplo, aunque se cree que la mayoría de las mutaciones sin sentido o en marcadas en los genes son alelos de pérdida de función (LOF) debido a la descomposición mediada por tonterías de la transcripción codificada, las mutaciones truncadas encontradas en los últimos exones escapan a este proceso y pueden funcionar como alelos benignos o de ganancia de función (GOF)⁶.

Por otra parte, predecir los efectos de un alelo de sentido erróneo es una tarea desalentadora, ya que puede dar lugar a una serie de diferentes escenarios genéticos como se describe por primera vez por Herman Muller en la década de 1930 (es decir, amorfo, hipómorfo, hipermorfo, antimorfo, neomorfo o isomorfo)⁷ . Numerosos programas y metodologías en silico se han desarrollado para predecir la patogenicidad de variantes de mala detección basadas en la conservación evolutiva, el tipo de cambio de aminoácidos, la posición dentro de un dominio funcional, la frecuencia del alelo en la población general, y otros parámetros⁸. Sin embargo, estos programas no son una solución integral para resolver el complicado problema de la interpretación de variantes. Curiosamente, un estudio reciente demostró que cinco algoritmos de predicción de patogenicidad variante ampliamente utilizados (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) están de acuerdo en la patogenicidad -80% del tiempo⁸ . En particular, incluso cuando todos los algoritmos están de acuerdo, devuelven una predicción incorrecta de patogenicidad hasta el 11% del tiempo. Esto no sólo conduce a una interpretación clínica defectuosa, sino que también puede disuadir a los investigadores de dar seguimiento a nuevas variantes al enumerarlas falsamente como benignas. Una forma de complementar la limitación actual del modelado de silico es proporcionar datos experimentales que demuestren el efecto de la función variante in vitro, ex vivo (por ejemplo, células cultivadas, organoides) o in vivo.

Los estudios funcionales in vivo de variantes asociadas a enfermedades raras en MO tienen fortalezas únicas¹³ y han sido adoptados por muchas iniciativas de investigación de enfermedades raras en todo el mundo, incluyendo la Red de Enfermedades No Diagnosticadas (UDN) en los Estados Unidos y Rare Redes de Modelos y Mecanismos de Enfermedades (RDMM) en Canadá, Japón, Europa y Australia¹⁴. Además de estos esfuerzos coordinados para integrar a los investigadores de MO en el flujo de trabajo de diagnóstico de enfermedades raras y estudios mecánicos a escala nacional, una serie de estudios de colaboración individuales entre investigadores clínicos y de MO han llevado al descubrimiento y la caracterización de muchos nuevos genes y variantes causantes de enfermedades humanas^82,83,84.

En la UDN, un Centro centralizado de Cribado de Organismos Modelo (MOSC) recibe presentaciones de genes y variantes candidatas con una descripción de la condición del paciente y evalúa si la variante es probable que sea patógena utilizando herramientas informáticas e in vivo Experimentos. En la Fase I (2015-2018) de la UDN, el MOSC comprendía un Núcleo Drosophila [Baylor College of Medicine (BCM)] y Zebrafish Core (Universidad de Oregón) que trabajaba en colaboración para evaluar casos. Utilizando el análisis informático y una serie de estrategias experimentales diferentes en Drosophila y pez cebra, el MOSC ha contribuido hasta ahora al diagnóstico de 132 pacientes, identificación de 31 nuevos síndromes^55,descubrimiento de varios nuevos genes de la enfermedad (p. ej., EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) y expansión fenotípica de la enfermedad conocida genes (por ejemplo, CACNA1A²¹,ACOX1²²).

Además de los proyectos dentro de la UDN, los investigadores del MOSC Drosophila Core han contribuido a los nuevos descubrimientos genéticos de la enfermedad en colaboración con los Centros de Genómica Mendeliana y otras iniciativas (por ejemplo, ANKLE2²³, TM2D3 ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) utilizando el mismo conjunto de informática y genética estrategias desarrolladas para la UDN. Dada la importancia de los estudios de MO sobre el diagnóstico de enfermedades raras, el MOSC se amplió para incluir un núcleo de C. elegans y un segundo núcleo de pez cebra (ambos en la Universidad de Washington en St. Louis) para la Fase II (2018-2022) de la UDN.

Este manuscrito describe un protocolo de estudio funcional in vivo que se utiliza activamente en el núcleo de Drosophila UDN MOSC para determinar si las variantes de mala detección tienen consecuencias funcionales en la proteína de interés utilizando moscas transgénicas que expresan Proteínas. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores de MO a trabajar en colaboración con grupos de investigación clínica para proporcionar evidencia experimental de que una variante candidata en un gen de interés tiene consecuencias funcionales, facilitando así el diagnóstico clínico. Este protocolo es más útil en un escenario en el que un investigador de Drosophila es abordado por un investigador clínico que tiene un paciente de enfermedad rara con una variante candidata específica en un gen de interés.

Este protocolo se puede dividir en tres elementos: (1) recopilar información para evaluar la probabilidad de que la variante de interés sea responsable del fenotipo del paciente y la viabilidad de un estudio funcional en Drosophila,(2) herramientas genéticas existentes y el establecimiento de otras nuevas, y (3) realizar estudios funcionales in vivo. El tercer elemento se puede subdividir en dos subelementos en función de cómo se puede evaluar la función de una variante de interés (experimento de rescate o estrategias basadas en sobreexpresión). Es importante tener en cuenta que este protocolo puede adaptarse y optimizarse a muchos escenarios fuera de la investigación de enfermedades monogénicas raras (por ejemplo, enfermedades comunes, interacciones gene-ambiente y pantallas farmacológicas/genéticas para identificar dianas terapéuticas). La capacidad de determinar la funcionalidad y la patogenicidad de las variantes no sólo beneficiará al paciente de interés al proporcionar un diagnóstico molecular preciso, sino que también tendrá impactos más amplios en la investigación científica tanto traslacional como básica.