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Genetics

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

このプロトコルの目的は、ショウジョウバエメラノガスターにおける生体内実験の設計と性能を概説し、ヒト疾患に関連する希少遺伝子変異体の機能的影響を評価することです。

Abstract

シーケンシング技術の進歩により、全ゲノムデータセットと全エキソメデータセットは、臨床診断と最先端のヒト遺伝学研究の両方でアクセスしやすくなりました。これらのデータセットで同定された変異体の病原性を予測するために多くのシリコアルゴリズムが開発されているが、特に誤った意味で、特定のゲノム変異体がタンパク質機能に与える影響を決定するには、機能的研究が重要である。バリアント。未診断疾患ネットワーク(UDN)およびその他の希少疾患研究コンソーシアムでは、ショウジョウバエ、C.エレガンス、ゼブラフィッシュ、マウスを含むモデル生物(MO)が、ヒト疾患を引き起こす原因の機能を評価するために積極的に使用されています。バリアント。このプロトコルは、UDNのモデル生物スクリーニングセンターショウジョウバエコアで使用される希少ヒト変異体の機能評価のための方法を説明する。ワークフローは、複数のパブリックデータベースから人間とMOの情報を収集することから始まり、MARRVELウェブリソースを使用して、バリアントが患者の状態に寄与する可能性があるかどうかを評価し、利用可能に基づいて効果的な実験を設計します。知識とリソース。次に、遺伝ツール(例えば、T2A-GAL4およびUAS-ヒトcDNAライン)が、ショウジョウバエに関心のある変異体の機能を評価するために生成される。これらの試薬の開発に際して、救助および過剰発現実験に基づく2極機能アッセイを行い、バリアント機能を評価することができます。救助分岐では、内因性フライ遺伝子は、直視性ショウジョウバエ遺伝子を参照または変異型ヒトトランスジーンに置き換えることによって「ヒト化」される。過剰発現分岐では、参照および変異体のヒトタンパク質は、種々の組織において外因性駆動される。いずれの場合も、任意の可視表現型(例えば、致死性、眼の形態、電気生理学)は、目的の疾患に関係なく、読み出しとして使用することができる。参照対立と変異対立性の間で観察された差異は、バリアント特異的効果を示唆し、したがって病原性の可能性が高い。このプロトコルは、既知および未知の機能を有する遺伝子の有病種のヒト疾患を引き起こす変異体の迅速な、生体内評価を可能にする。

Introduction

稀な疾患を持つ患者は、正確な診断1を得るために「診断オデッセイ」と呼ばれる困難な旅をしばしば受ける。ほとんどの希少疾患は、強い遺伝的起源を持っていると考えられています, 遺伝的/ゲノム分析は、臨床ワークアップの重要な要素を作ります.染色体マイクロアレイに基づく候補遺伝子パネルシーケンシングおよびコピー数変動解析に加えて、全エキソメ(WES)および全ゲノムシーケンシング(WGS)技術は、過去10年間でますます価値のあるツールとなっています2, 3.現在、WESおよびWGSにおける既知の病原性変異体を同定するための診断率は〜25%(小児症例では高い)4、5である。臨床WES/WGSの後に未診断のままであるほとんどの場合、一般的な問題は、多くの候補遺伝子と変異体があることです。次世代シーケンシングは、多くの遺伝子で新規または超希少な変異体を識別することが多く、これらの変異体が疾患発現型に寄与するかどうかを解釈することは困難です。例えば、遺伝子のほとんどのナンセンスまたはフレームシフト変異は、エンコードされた転写物のナンセンス媒介的な崩壊による機能喪失(LOF)の対遺物であると考えられているが、最後のエキソンで見つかった切り捨て変異はこのプロセスをエスケープし、良性または機能利得 (GOF) アエレ6.

さらに、誤った対立遺伝子の影響を予測することは、1930年代にハーマン・ミュラーによって最初に説明された多くの異なる遺伝的シナリオをもたらす可能性があるため、困難な作業です(すなわち、アモーフ、低型、高型、反形態、新形、または同位形)7.シリコプログラムおよび方法論の多数は、進化的保存、アミノ酸変化の種類、機能ドメイン内の位置、一般集団における対立遺伝子頻度に基づいて誤感変異体の病原性を予測するために開発された。およびその他のパラメータ8.しかし、これらのプログラムは、バリアント解釈の複雑な問題を解決するための包括的なソリューションではありません。興味深いことに、最近の研究では、5つの広く使用される変異原性予測アルゴリズム(ポリフェン9、SIFT10、CADD11、PROVEAN12、突然変異テイサー)が病原性〜80%の時間に同意することを実証しました8.特に、すべてのアルゴリズムが同意した場合でも、病原性の誤った予測を11%まで返します。これは、欠陥のある臨床解釈につながるだけでなく、研究者が良性として誤ってリストすることによって、新しい変異体のフォローアップを妨げる可能性があります。シリコモデリングにおける現在の限界を補完する1つの方法は、インビトロ、exvivo(例えば、培養細胞、オルガノイド)、または生体内での変異関数の効果を実証する実験データを提供することである。

MOにおける希少疾患関連変異体の生体内機能研究では、独自の強みを有し、米国および希少疾患ネットワーク(UDN)を含む世界中の多くの希少疾患研究イニシアチブで採用されている。カナダ、日本、ヨーロッパ、オーストラリアの疾病モデル&メカニズム(RDMM)ネットワーク14.MO研究者を全国規模で希少疾患診断と機械的研究のワークフローに統合するための協調的な取り組みに加えて、臨床研究者とMO研究者の間の個々の共同研究の数は、発見につながっています。多くの新しいヒト疾患を引き起こす遺伝子および変異体の特徴付け82,83,84.

UDNでは、集中型モデル生物スクリーニングセンター(MOSC)は、患者の状態の説明を含む候補遺伝子および変異体の提出を受け取り、その変異体がインフォマティクスツールと生体内で病原性である可能性があるかどうかを評価する。実験。UDNのフェーズI(2015-2018)では、MOSCはショウジョウバエコア(ベイラー医科大学(BCM))とゼブラフィッシュコア(オレゴン大学)で構成され、症例を評価するために協力しました。情報学分析とショウジョウバエとゼブラフィッシュのさまざまな実験戦略を使用して、MOSCはこれまでに132人の患者の診断、31の新しい症候群55の同定、いくつかの新しいヒトの発見に貢献してきました。疾患遺伝子(例えば、EBF315、ATP5F1D 16、TBX2 17、IRF2BPL 18、COG4 19、WDR37 20)および既知疾患の発現拡張遺伝子(例えば、CACNA1A21、ACOX122)。

UDN内のプロジェクトに加えて、MOSCショウジョウバエコア研究者は、メンデリアンゲノミクスセンターやその他のイニシアチブ(例えば、ANKLE2 23、TM2D3)と協力して新しい疾患遺伝子発見に貢献してきました。 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) 情報学と遺伝学の同じセットを使用してUDN のために開発された戦略。希少疾患診断に関するMO研究の意義を考えると、MOSCはUDNのフェーズII(2018-2022)のためのC.エレガンスコアと第2ゼブラフィッシュコア(セントルイスのワシントン大学の両方)を含むように拡張されました。

この原稿は、誤感変異体がヒトを発現するトランスジェニックハエを使用して目的のタンパク質に機能的な影響を及ぼすかどうかを判断するためにUDN MOSCショウジョウバエコアで積極的に使用されている生体内機能研究プロトコルについて説明します。タンパク質。このプロトコルの目的は、MO研究者が臨床研究グループと協力して、対象遺伝子の候補バリアントが機能的な結果を有し、臨床診断を容易にするという実験的証拠を提供するのを助けることを目的としています。このプロトコルは、ショウジョウバエの研究者が関心のある遺伝子に特定の候補変異体を有する稀な疾患患者を持つ臨床研究者によってアプローチされるシナリオで最も有用である。

このプロトコルは、(1)患者表現型に関与する関心のバリアントの可能性と、(2)収集における機能的研究の実現可能性を評価するための情報の収集という3つの要素に分けることができます。既存の遺伝的ツールを確立し、新しいものを確立し、(3)生体内で機能的研究を行う。3番目の要素は、対象のバリアントの関数を評価する方法に基づいて、さらに2つのサブエレメントに細分化することができます(救助実験または過剰発現ベースの戦略)。このプロトコルは、まれな単原性疾患研究以外の多くのシナリオ(例えば、一般的な疾患、遺伝子環境相互作用、および治療標的を同定するための薬理学的/遺伝的スクリーン)以外の多くのシナリオに適応および最適化できることに注意することが重要です。変異体の機能性と病原性を決定する能力は、正確な分子診断を提供することによって関心のある患者に利益をもたらすだけでなく、翻訳と基礎科学研究の両方に広範な影響を与えます。

Protocol

1. ヒトおよびMO情報の収集:ショウジョウバエにおける疾患表現型と機能的研究の実現可能性に対する関心の変異体の可能性 広範なデータベースおよび文献検索を実行して、目的の特定の遺伝子および変異体が、対象患者の表現型を説明するのに適しているかどうかを判断する。具体的には、以下の情報を収集します。 目的の遺伝子が以前に他の遺伝性疾患(…

Representative Results

神経発達型に関連するEBF3におけるデノボミスセンス変異体の機能的研究低血圧、運動失調、世界的な発達遅延、発現性言語障害を含む神経発達表現型を有する7歳の男性において、国立衛生研究所の医師およびヒト遺伝学者(UDP)。EBF3(早期B細胞因子3)15におけるデノボ誤知覚変異体(p.R163Q)を同定し、COE(コリアー/嗅覚-1/早期B細胞因子)ファミ?…

Discussion

ショウジョウバエメラノガスターを用した実験的研究は、疾患関連ヒト変異体の結果を評価するための堅牢なアッセイシステムを提供する。これは、過去1世紀89年にフライフィールドの多くの研究者によって生成された知識と多様な遺伝的ツールの大規模なボディによるものです.しかし、他の実験システムと同様に、存在する注意事項と制限事項を認識することが重…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、原稿の批判的な読み取りのためにホセサラザール、ジュリア王、カレン・シュルツ博士に感謝します。我々は、ここで議論したTBX2変異体の機能特性に関して、ニン・リウ博士とXi Luo博士を認める。未診断疾患ネットワークモデル生物スクリーニングセンターは、国立衛生研究所(NIH)共通基金(U54 NS093793)を通じて支援されました。H. T. C. はさらに、NIH[CNCDP-K12 および NINDS(1K12 NS098482)]、米国神経学アカデミー(神経科学研究助成金)、バロウズウェルカム基金(医学科学者キャリア賞)、児童神経学会および小児神経学財団()PERFエルターマン助成金)とNIHディレクターの早期独立賞(DP5 OD026426)。M.F.W.はサイモンズ財団(SFARI賞:368479)によってさらに支援されました。S.Y.はさらに、NIH(R01 DC014932)、サイモンズ財団(SFARI賞:368479)、アルツハイマー病協会(新研究者研究助成金:15-364099)、ナマン家族基礎研究基金、キャロライン・ウィーズ研究のための法律基金によってさらに支援されました。分子医学BCMの共焦点顕微鏡検査は、NIHグラントU54HD083092によって知的発達障害研究センター(IDDRC)神経可視化コアに一部サポートされています。

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
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Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
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