JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

Abstract

ההתקדמות בטכנולוגיית רצף יש הפכו שלמים-הגנום ואת כל-exome datasets נגיש יותר עבור האבחון הקליני והן חדשני המחקר גנטיקה אנושית. למרות מספר אלגוריתמים סיליקו פותחו כדי לחזות את הפתוגניות של משתנים המזוהים אלה ערכות נתונים, מחקרים פונקציונליים הם קריטיים כדי לקבוע כיצד משתנים גנומית ספציפיים להשפיע על תפקוד החלבון, במיוחד עבור חוסר הגיון גרסאות. ברשת מחלות לא מאובחנים (UDN) ועוד מחקר נדיר קונסורציומים מחלות, אורגניזמים מודל (MO) כולל Drosophila ילה, ג. אלגיה, zebrafish, ועכברים משמשים באופן פעיל כדי להעריך את התפקוד של מחלת האדם הפיוטי הגורם גרסאות. פרוטוקול זה מתאר שיטה להערכת תפקודית של משתנים אנושיים נדירים המשמשים את מודל אורגניזמים ההקרנה מרכז Drosophila ילה ליבה של udn. זרימת העבודה מתחילה עם איסוף מידע אנושי ו-MO ממסדי נתונים ציבוריים מרובים, באמצעות משאב האינטרנט MARRVEL כדי להעריך אם המשתנה עשוי לתרום למצבו של המטופל, כמו גם לעצב ניסויים יעילים המבוססים על זמין ידע ומשאבים. הבא, כלים גנטיים (למשל, T2A-GAL4 ו-UAS-האדם קווי cDNA) נוצרות כדי להעריך את הפונקציות של משתנים של עניין Drosophila. לאחר התפתחות של אלה ריאגנטים, שני שניתן פונקציונלי הפונקציונליות המבוססת על הצלה וניסויים overexpression יטוי ניתן לבצע כדי להעריך את הפונקציה variant. בענף ההצלה, הגנים האנדוגניים של הזבוב הם “הומניזציה” על-ידי החלפת הגן האורטו-סטריהאלי עם התייחסות או שינוי הטרנסגנים האנושיים. בענף של ביטוי יתר, ההתייחסות והחלבונים האנושיים המשתנה מונעים באופן מוגזם במגוון של רקמות. בשני המקרים, כל הפנוטיפ (למשל, הלליות, מורפולוגיה של העין, אלקטרופיזיולוגיה) יכול לשמש כקריאה-out, ללא קשר למחלת הריבית. הבדלים שנצפו בין התייחסות לאלה של המשתנה מצביעים על האפקט הספציפי למשתנה, ולכן כנראה פתוגניות. פרוטוקול זה מאפשר מהיר, בהערכות vivo של מחלת האדם האנושי הגורמת למחלות של גנים עם פונקציות ידועות ובלתי ידועות.

Introduction

חולים עם מחלות נדירות עוברים לעתים קרובות מסע מפרך המכונה “אודיסיאה האבחון” כדי לקבל אבחנה מדויקת1. מחלות נדירות ביותר הם חשבו שיש מוצא גנטי חזק, מה שהופך גנטית/גנומית מנתח אלמנטים קריטיים של הבדיקות הקליניות. בנוסף על רצפי המועמדים של פאנל הגן ולהעתיק ניתוח וריאציה מספר מבוסס על מיקרו מערכים כרומוזומלית, exome שלמה (ווס) ו-רצף הגנום כולו (WGS) טכנולוגיות הפכו כלים יקרי ערך יותר ויותר בעשור האחרון2, 3. שלוש. כיום, שיעור אבחון לזיהוי משתנה פתוגניים ידוע ב ווס ו-wgs הוא ~ 25% (גבוה יותר במקרים של ילדים)4,5. עבור רוב המקרים שנשארים לא מאובחנים לאחר ווס קליני/WGS, בעיה נפוצה היא שיש גנים מועמדים רבים ומשתנים. רצפי הדור הבא לעתים קרובות מזהה משתנים חדשניים או אולטרה נדירים בגנים רבים, ולפרש אם אלה גרסאות לתרום פנוטיפים למחלות הוא מאתגר. לדוגמה, למרות שרוב השטויות או מוטציות frameshift בגנים נחשבים אובדן של פונקציה (lof) אללים בשל השטויות בתיווך ריקבון של תעתיק מקודד, לחתוך מוטציות למצוא את exons האחרון לברוח תהליך זה עשוי לתפקד כ שפיר או רווח של הפונקציה (gof) אללים6.

יתר על כן, חיזוי ההשפעות של אלל מוטעית היא משימה מרתיעה, שכן הוא יכול לגרום למספר תרחישים גנטיים שונים כפי שמתואר לראשונה על ידי הרמן מולר בשנות ה -30 (כלומר, amorph, hypורפולוגיה, מורף, מורף, נאואומph, או isomorph)7 . רבים בתוכניות סיליקו ומתודולוגיות פותחו כדי לחזות את הפתוגניות של משתנים מוטעית מבוסס על שימור אבולוציוני, סוג של שינוי חומצת אמינו, מיקום בתוך תחום פונקציונלי, תדר אלל באוכלוסיה הכללית, ופרמטרים אחרים8. עם זאת, תוכניות אלה אינן פתרון כולל כדי לפתור את הבעיה המורכבת של פרשנות משתנה. מעניין, מחקר שנערך לאחרונה הראה כי חמש השתמשו באופן נרחב באלגוריתמים לחיזוי משתנה (Polyphen9, סינון10, cadd11, provean12, טועם מוטציה) מסכימים על פתוגניות ~ 80% מהזמן8 . בעיקר, גם כאשר כל האלגוריתמים מסכימים, הם מחזירים חיזוי שגוי של הפתוגניות עד 11% מהזמן. זה לא רק מוביל פרשנות קלינית פגומה אלא גם יכול להניא חוקרים מפני בעקבות משתנים חדשים על ידי רישום כוזב להם כמו שפיר. אחת הדרכים להשלים את המגבלה הנוכחית של מידול סיליקו היא לספק נתונים ניסיוניים המדגימה את ההשפעה של פונקציה משתנה בתוך מבחנה, לשעבר vivo (g., תאים מתורבתים, אורגנואידים), או בvivo.

ב vivo מחקרים פונקציונליים של מחלות נדירות הקשורות למשתנים ב-MO יש כוחות ייחודיים13 ואומצו על ידי יוזמות רבות נדיר מחקר מחלות ברחבי העולם, כולל רשת מחלות לא מאובחנים (udn) בארצות הברית נדיר מחלות מודלים & מנגנונים (RDMM) רשתות בקנדה, יפן, אירופה, ואוסטרליה14. בנוסף מאמצים אלה מתואמים לשלב חוקרים MO לתוך זרימת העבודה של אבחון מחלות נדירות ולימודי מכניסטיים בקנה מידה לאומי, מספר מחקרים שיתופי בודדים בין חוקרים קליניים ו-MO הובילו את התגלית ואפיון של גנים רבים הגורמים למחלות האדם החדש ומשתנים82,83,84.

ב UDN, מרכזי מודל אורגניזמים ההקרנה מרכז (MOSC) מקבל הגשות של גנים המועמדים ומשתנים עם תיאור של המצב של המטופל ומעריך אם המשתנה עשוי להיות פתוגניים באמצעות כלים אינפורמטיקה ובvivo ניסויים. בשלב I (2015-2018) של UDN, MOSC המורכבת של דרוזוהילה ליבה [ביילור המכללה לרפואה (bcm)] ו Zebrafish Core (אוניברסיטת אורגון) כי עבד בשיתוף פעולה כדי להעריך את המקרים. באמצעות ניתוח אינפורמטיקה ומספר אסטרטגיות ניסיוני שונות ב Drosophila ילה ו zebrafish, MOSC יש עד כה תרם לאבחנה של 132 חולים, זיהוי של 31 תסמונות חדשות55, גילוי של מספר אנשים חדשים גנים של מחלות (לדוגמה, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) והתרחבות פנוטינית של המחלה הידועה גנים (לדוגמה, CACNA1A21, ACOX122).

בנוסף לפרויקטים בתוך UDN, MOSC Drosophila ילה ליבה חוקרים תרמו תגליות גנים מחלות חדשות בשיתוף פעולה עם המרכזים לגנומיקה של Mendelian ויוזמות אחרות (למשל, ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) באמצעות אותה קבוצה של אינפורמטיקה וגנטית אסטרטגיות שפותחו עבור UDN. בהתחשב במשמעות של מחקרי מו על אבחון מחלות נדירות, MOSC הורחב כדי לכלול C. אלגיה ליבה וליבת Zebrafish השני (הן באוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) עבור שלב II (2018-2022) של udn.

כתב יד זה מתאר בפרוטוקול המחקר vivo פונקציונלי המשמש באופן פעיל ב-UDN MOSC Drosophila Core כדי לקבוע אם משתנים מוטעית יש השלכות פונקציונליות על חלבון העניין באמצעות זבובים טרנסגניים המבטאים את האדם חלבונים. המטרה של פרוטוקול זה היא לעזור לחוקרים MO לעבוד בשיתוף פעולה עם קבוצות מחקר קליני כדי לספק ראיות ניסיוני כי משתנה מועמד בגן של עניין יש השלכות פונקציונליות, ובכך להקל על אבחנה קלינית. פרוטוקול זה הוא שימושי ביותר בתרחיש שבו חוקר דרוזוהילה מתקרב לחוקר קליני בעל חולה מחלות נדיר עם משתנה מועמד ספציפי בגן של עניין.

פרוטוקול זה ניתן לשבור לשלושה אלמנטים: (1) איסוף מידע כדי להעריך את הסבירות של משתנה העניין להיות אחראי על הטיפול המטופל ואת הכדאיות של מחקר פונקציונלי בדרוסופילה, (2) איסוף כלים גנטיים קיימים והקמת חדשים, ו (3) ביצוע מחקרים פונקציונליים בvivo. האלמנט השלישי יכול עוד להיות מחולק לשני תת רכיבי מבוסס על איך הפונקציה של וריאציה של עניין יכול להיות מוערך (ניסוי הצלה או ביטוי יתר אסטרטגיות מבוססות). חשוב לציין כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם וממוטב לתרחישים רבים מחוץ למחקר נדיר מחלות מונוגניים (למשל, מחלות נפוצות, אינטראקציה גנטית-סביבה, ו תרופתי/גנטי מסכים לזיהוי מטרות טיפוליות). היכולת לקבוע את הפונקציונליות ואת הפתוגניות של משתנים לא רק להועיל החולה של עניין על ידי מתן אבחנה מולקולרית מדויק, אבל יהיו גם השפעות רחבות יותר על המחקר המדעי הבסיסי ובסיסי.

Protocol

1. איסוף מידע אנושי ו-MO כדי להעריך: הסבירות של משתנה של עניין להיות אחראי על פנוטיפים למחלות והיתכנות של לימודים פונקציונליים בדרוסופילה בצע חיפושים נרחבים במסד הנתונים ובספרות כדי לקבוע אם הגנים והמשתנים הספציפיים של הריבית הם מועמדים טובים כדי להסביר את הפנוטיפ של המטופל …

Representative Results

המחקר הפונקציונלי של דה נובו מוטעית Variant ב EBF3 מקושרים לפנוטיפים נוירוהתפתחותייםבזכר בן 7 עם פנוטיפים נוירוטיביים כולל היפוטוניה, אטקסיה, עיכוב התפתחותי גלובלי, והפרעת דיבור הבעה, רופאים וגנטיקאים האדם במכון הלאומי לבריאות לא אובחן מחלות (UDP) זיהה גרסה דה נובו מוטעית (p….

Discussion

מחקרים ניסיוניים המשתמשים בדרוסופילה מלאנוסטר מספקים מערכת שיטה איתנה להערכת ההשלכות של מחלות אנושיות הקשורות למחלות. זאת בשל הגוף הגדול של ידע וכלים גנטיים מגוונים שנוצרו על ידי חוקרים רבים בשדה לטוס במהלך המאה האחרונה89. עם זאת, בדיוק כמו בכל מערכת ניסיונית אחרת, חשוב ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לחוסה סלזאר, ג’וליה וואנג וד ר קרן שולץ על הקריאה הקריטית של כתב היד. אנו מכירים בד. נינג ליו ו-Xi לואו על האפיון התפקודי של משתני TBX2 שנדונו כאן. לא אובחן מחלות רשת מודל אורגניזמים מרכז הקרנה נתמכת באמצעות המכון הלאומי לבריאות (NIH) הקרן המשותפת (U54 NS093793). H. T. C היה נתמך עוד יותר על ידי NIH [CNCDP-K12 ו NINDS (1K12 NS098482)], האקדמיה האמריקנית לנוירולוגיה (מחקר במחקר מדעי המוח), בורוז בראש קרן (פרס קריירה עבור מדענים רפואיים), הילד נוירולוגיה החברה ונוירולוגיה הילד הקרן ( מענק PERF אלטרמן), ופרס העצמאות המוקדמת של מנהל NIH (DP5 OD026426). מסיה פ. ו. נתמך עוד יותר על ידי קרן סימונס (פרס הספרי: 368479). ס. י. הייתה נתמכת עוד יותר על ידי ה-NIH (R01 DC014932), קרן סימונס (פרס הספרי: 368479), אגודת האלצהיימר (מלגת מחקר לחוקרים חדשים: 15-364099), קרן משפחת נאמאן למחקר בסיסי, והקרן קרוליין ווילס למחקר ב . רפואה מולקולרית מיקרוסקופ confocal וקדי ב BCM נתמך בחלקו על ידי NIH גרנט U54HD083092 למרכז המחקר האינטלקטואלי וההתפתחותי לקויות (IDDRC) ליבה נוירוהדמיה.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image