JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

في فيفو دراسة وظيفية من المتغيرات البشرية النادرة المرتبطة بالأمراض باستخدام دروسوفيلا

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو تحديد تصميم وأداء التجارب في الجسم الحي في دروسوفيلا melanogaster لتقييم العواقب الوظيفية للمتغيرات الجينية النادرة المرتبطة بالأمراض البشرية.

Abstract

وقد أدى التقدم المحرز في تكنولوجيا التسلسل إلى جعل مجموعات البيانات المتعلقة بالجينوم الكامل ومجموعة البيانات الكاملة إمكانية الوصول إلى كل من التشخيص السريري والبحوث المتطورة في مجال علم الوراثة البشرية. على الرغم من أنه تم تطوير عدد من خوارزميات السيليكو للتنبؤ بمسببات الأمراض من المتغيرات المحددة في مجموعات البيانات هذه، فإن الدراسات الوظيفية حاسمة لتحديد كيفية تأثير المتغيرات الجينية المحددة على وظيفة البروتين، وخاصة بالنسبة للأخطاء المتغيرات. في شبكة الأمراض غير المشخصة (UDN) وغيرها من اتحادات البحوث الأمراض النادرة، وتستخدم الكائنات الحية النموذجية (MO) بما في ذلك Drosophila، C. elegans، حمار وحشي ، والفئران بنشاط لتقييم وظيفة المفترضة التي تسبب الأمراض البشرية المتغيرات. يصف هذا البروتوكول طريقة للتقييم الوظيفي للمتغيرات البشرية النادرة المستخدمة في مركز فحص الكائنات الحية النموذجية Drosophila Core of UDN. يبدأ سير العمل بجمع المعلومات البشرية ومعلومات MO من قواعد بيانات عامة متعددة، وذلك باستخدام مورد الويب MARRVEL لتقييم ما إذا كان من المرجح أن يساهم البديل في حالة المريض، فضلا عن تصميم تجارب فعالة على أساس المتاحة المعرفة والموارد. بعد ذلك، يتم إنشاء الأدوات الوراثية (على سبيل المثال، T2A-GAL4 وخطوط UAS-human cDNA) لتقييم وظائف المتغيرات ذات الاهتمام في دروسوفيلا. وعند تطوير هذه الكواشف، يمكن إجراء عمليات فحص وظيفية ذات شقين تستند إلى تجارب الإنقاذ والتعبير المفرط لتقييم وظيفة المتغيرات. في فرع الإنقاذ، يتم “أنسنة” جينات ذبابة الذاتية عن طريق استبدال جين دروسوفيلا التقويمية مع مرجع أو الجينات البشرية البديلة. في فرع التعبير المفرط، يتم دفع البروتينات البشرية المرجعية والبديلة بشكل خارجي في مجموعة متنوعة من الأنسجة. في كلتا الحالتين، يمكن استخدام أي نمط ظاهري قابل للتآكل (مثل الفتك، ومورفولوجيا العين، والفيزيولوجيا الكهربائية) كقراءة، بغض النظر عن مرض الفائدة. الاختلافات التي لوحظت بين الأليلات المرجعية والبديلة تشير إلى تأثير متغير محدد، وبالتالي من المحتمل أن تكون الإمراض. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييمات سريعة في الجسم الحي للمتغيرات المسببة للأمراض البشرية المفترضة للجينات ذات الوظائف المعروفة وغير المعروفة.

Introduction

المرضى الذين يعانون من أمراض نادرة غالبا ما تخضع لرحلة شاقة يشار إليها باسم “أوديسي التشخيص” للحصول على تشخيص دقيق1. ويعتقد أن معظم الأمراض النادرة لها أصل وراثي قوي، مما يجعل التحليلات الوراثية/الجينية عناصر حاسمة من العمل السريري. بالإضافة إلى تسلسل لوحة الجينات المرشحة وتحليل تباين عدد النسخ استناداً إلى المصفوفات الدقيقة الكروموسومية، أصبحت تقنيات التسلسل الكامل للجينوم وتسلسل الجينوم الكامل أدوات قيّمة بشكل متزايد على مدى العقد الماضي2، 3. حاليا، معدل التشخيص لتحديد متغير مسببات الأمراض المعروفة في WES وWGS هو ~ 25٪ (أعلى في حالات الأطفال)4،5. بالنسبة لمعظم الحالات التي لا تزال غير مشخصة بعد WES السريرية / WGS، وهناك مسألة شائعة هي أن هناك العديد من الجينات المرشحة والمتغيرات. غالباً ما يحدد الجيل التالي من التسلسل المتغيرات الجديدة أو النادرة جدًا في العديد من الجينات، وتفسير ما إذا كانت هذه المتغيرات تساهم في الأنماط الظاهرية للأمراض أمر صعب. على سبيل المثال، على الرغم من أن معظم الهراء أو الطفرات frameshift في الجينات ويعتقد أن فقدان الوظيفة (LOF) الأليلات بسبب الاضمحلال بوساطة هراء من النص المشفر، واقتطاع الطفرات وجدت في الexons الماضي الهروب من هذه العملية، ويمكن أن تعمل كما حميدة أو كسب وظيفة (GOF) alleles6.

وعلاوة على ذلك، فإن التنبؤ بآثار الأليل الخاطئ مهمة شاقة، لأنه يمكن أن يؤدي إلى عدد من السيناريوهات الوراثية المختلفة كما وصفها هيرمان مولر لأول مرة في الثلاثينات (أي غير متبلور، هيمورف، فرط الشكل، مضاد للمورفّف، نيومورف، أو إيزومورف)7 . وقد وضعت العديد من في برامج silico والمنهجيات للتنبؤ المسببة للأمراض من المتغيرات missense على أساس الحفظ التطوري، ونوع من تغيير الأحماض الأمينية، ووضع داخل مجال وظيفي، تردد أليل في عموم السكان، وغيرها منالمعلمات 8. ومع ذلك، هذه البرامج ليست حلا شاملا لحل المشكلة المعقدة لتفسير متغير. ومن المثير للاهتمام، أظهرت دراسة حديثة أن خمس خوارزميات التنبؤالمسببة للأمراض البديل المستخدمة على نطاق واسع (بوليفين 9، SIFT10، CADD11، PROVEAN12، متذوق الطفرة) تتفق على الإمراض ~ 80٪ من الوقت8 . وتجدر الإشارة إلى أنه حتى عندما تتفق جميع الخوارزميات، فإنها تعيد تنبؤاً غير صحيح بالإمراض يصل إلى 11% من الوقت. وهذا لا يؤدي فقط إلى تفسير سريري معيب ولكن أيضا قد يثني الباحثين عن متابعة المتغيرات الجديدة عن طريق إدراجها زورا بأنها حميدة. إحدى الطرق لاستكمال القيد الحالي في النمذجة السيليكو هو توفير البيانات التجريبية التي تبين تأثير وظيفة متغير في المختبر, فيالجسم الحي السابق (على سبيل المثال, الخلايا المستزرعة, organoids), أو في الجسم الحي.

في الدراسات الوظيفية في الجسم الحي من المتغيرات المرتبطة بالأمراض النادرة في MO لديها نقاط قوة فريدةمن نوعها 13 وقد اعتمدت من قبل العديد من المبادرات البحثية الأمراض النادرة في جميع أنحاء العالم، بما في ذلك شبكة الأمراض غير المشخصة (UDN) في الولايات المتحدة ونادرة نماذج الأمراض والآليات (RDMM) شبكات في كندا واليابان وأوروبا وأستراليا14. بالإضافة إلى هذه الجهود المنسقة لدمج الباحثين MO في سير عمل تشخيص الأمراض النادرة والدراسات الميكانيكية على نطاق وطني، أدى عدد من الدراسات التعاونية الفردية بين الباحثين السريرية وMO إلى اكتشاف وتوصيف العديد من الجينات والمتغيرات الجديدة المسببة للأمراض البشرية82و83و84.

في UDN، يتلقى مركز فحص الكائنات النموذجية المركزية (MOSC) تقديمات من الجينات والمتغيرات المرشحة مع وصف لحالة المريض ويقيّم ما إذا كان من المحتمل أن يكون البديل مسبب ًا للأمراض باستخدام أدوات المعلوماتية وفي الجسم الحي التجارب. في المرحلة الأولى (2015-2018) من UDN، تتألف MOSC من دور دروسوفيلا الأساسية [كلية بايلور للطب (BCM)] وحمار وحشي كور (جامعة أوريغون) التي عملت بشكل تعاوني لتقييم الحالات. باستخدام تحليل المعلوماتية وعدد من الاستراتيجيات التجريبية المختلفة في دروسوفيلا وحمار وحشي، وقد ساهمت MOSC حتى الآن في تشخيص 132 مريضا، وتحديد 31 متلازمة جديدة55،واكتشاف العديد من الإنسان الجديد جينات المرض (على سبيل المثال، EBF315، ATP5F1D16، TBX217، IRF2BPL18، COG419، WDR3720)والتوسع phenotypic من الأمراض المعروفة الجينات (على سبيل المثال، CACNA1A21، ACOX122).

بالإضافة إلى المشاريع داخل UDN، ساهم الباحثون MOSC Drosophila الأساسية في اكتشافات جينية جديدة للمرض بالتعاون مع مراكز الجينوم المندلية وغيرها من المبادرات (على سبيل المثال، ANKLE223، TM2D3 24، NRD125، OGDHL25، ATAD3A26، ARIH127، MARK328، DNMBP29) باستخدام نفس المجموعة من المعلوماتية والوراثية الاستراتيجيات التي وضعت للUDN. وبالنظر إلى أهمية دراسات وزارة الصحة بشأن تشخيص الأمراض النادرة، تم توسيع نطاق الـ MOSC ليشمل النواة C. elegans وجوهر سمك الحمار الوحشي الثاني (كلاهما في جامعة واشنطن في سانت لويس) للمرحلة الثانية (2018-2022) من UDN.

تصف هذه المخطوطة بروتوكول دراسة وظيفية في الجسم الحي يستخدم بنشاط في الـ UDN MOSC Drosophila Core لتحديد ما إذا كانت المتغيرات غير المنطقية لها عواقب وظيفية على البروتين الذي يهمه الأمر باستخدام الذباب المعدل وراثياً الذي يعبر عن الإنسان البروتينات. والهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة الباحثين MO العمل بالتعاون مع مجموعات البحوث السريرية لتقديم أدلة تجريبية على أن البديل المرشح في جين من الفائدة له عواقب وظيفية، وبالتالي تسهيل التشخيص السريري. هذا البروتوكول هو الأكثر فائدة في السيناريو الذي يتم الاتصال بالباحث Drosophila من قبل محقق سريري لديه مريض مرض نادر مع متغير مرشح معين في جين من الفائدة.

ويمكن تقسيم هذا البروتوكول إلى ثلاثة عناصر: (1) جمع المعلومات لتقييم احتمال أن يكون البديل من الفائدة المسؤولة عن النمط الظاهري للمريض وجدوى دراسة وظيفية في دروسوفيلا، (2) جمع الأدوات الوراثية الموجودة وإنشاء أدوات جديدة، و (3) إجراء دراسات وظيفية في الجسم الحي. ويمكن تقسيم العنصر الثالث كذلك إلى عنصرين فرعيين يستندان إلى كيفية تقييم وظيفة متغير من الاهتمامات (تجربة الإنقاذ أو الاستراتيجيات القائمة على التعبير المفرط). ومن المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يمكن تكييفه وتحسينه إلى حد كبير مع العديد من السيناريوهات خارج بحوث الأمراض المونوجينية النادرة (مثل الأمراض الشائعة، والتفاعلات بين الجينات والبيئة، والشاشات الدوائية/الجينية لتحديد الأهداف العلاجية). القدرة على تحديد وظيفة وإمراض المتغيرات لن تستفيد فقط المريض من الاهتمام من خلال توفير التشخيص الجزيئي الدقيق ولكن سيكون لها أيضا آثار أوسع على كل من البحث العلمي الترجمة والأساسية.

Protocol

1. جمع المعلومات البشرية وMO لتقييم: احتمال وجود متغير من الفائدة تكون مسؤولة عن الأنماط الظاهرية للمرض وجدوى الدراسات الوظيفية في دروسوفيلا إجراء عمليات بحث واسعة في قاعدة البيانات والأدب لتحديد ما إذا كانت الجينات والمتغيرات المحددة ذات الأهمية هي مرشحة جيدة لشرح النمط ال…

Representative Results

دراسة وظيفية من دي نوفو Missense البديل في EBF3 مرتبطة الأنماط الظاهرية العصبيةفي ذكر يبلغ من العمر 7 سنوات مع الأنماط الظاهرية العصبية التنموية بما في ذلك نقص التوتر، والترنح، وتأخر النمو العالمي، واضطراب الكلام التعبيري، والأطباء وعلماء الوراثة البشرية في المعاهد الوطنية لل…

Discussion

توفر الدراسات التجريبية باستخدام Drosophila melanogaster نظام تقييم قوي لتقييم عواقب المتغيرات البشرية المرتبطة بالأمراض. ويرجع ذلك إلى مجموعة كبيرة من المعرفة والأدوات الوراثية المتنوعة التي تم إنشاؤها من قبل العديد من الباحثين في مجال الطيران على مدى القرن الماضي89. ومع ذلك، فإ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر خوسيه سالازار وجوليا وانغ والدكتورة كارين شولتز على القراءة النقدية للمخطوطة. ونحن نعترف الدكتورين نينغ ليو وشي لو للتوصيف الوظيفي للمتغيرات TBX2 التي نوقشت هنا. تم دعم مركز فحص الكائنات الحية النموذجية للأمراض غير المشخصة من خلال الصندوق المشترك للمعاهد الوطنية للصحة (U54 NS093793). H. T. C. كما تم دعمها من قبل NIH [CNCDP-K12 وNINDS (1K12 NS098482)] ، الأكاديمية الأمريكية لعلم الأعصاب (منحة أبحاث علم الأعصاب)، صندوق بوروز ويلكوم (جائزة مهنية للعلماء الطبيين)، جمعية طب الأعصاب لدى الأطفال ومؤسسة طب الأعصاب لدى الأطفال ( منحة بيرف الترمان)، وجائزة الاستقلال المبكر لمدير المعهد الوطني للصحة (DP5 OD026426). كما حظيت بالدعم من مؤسسة سيمونز (جائزة SFARI: 368479). S. Y. بدعم كذلك من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 DC014932)، ومؤسسة سيمونز (جائزة SFARI: 368479)، وجمعية الزهايمر (منحة البحث الباحث الجديد: 15-364099)، صندوق الأسرة نعمان للبحوث الأساسية، وكارولين ويس صندوق القانون للبحوث في الطب الجزيئي. يتم دعم الفحص المجهري البؤري في BCM جزئيامن قبل NIH منحة U54HD083092 لمركز بحوث الإعاقات الذهنية والتنموية (IDDRC) نواة التصور العصبي.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image