JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Published: August 20, 2019
doi:
10.3791/59658
, , , ,
1Department of Molecular and Human Genetics,Baylor College of Medicine, 2Program in Developmental Biology,Baylor College of Medicine, 3Department of Pediatrics, Section of Neurology and Developmental Neuroscience,Baylor College of Medicine, 4Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute,Texas Children’s Hospital, 5Department of Neuroscience,Baylor College of Medicine

Summary

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster’deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Abstract

Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, hem klinik tanı hem de son teknoloji insan genetiği araştırmaları için tüm genom ve tüm eknom veri kümelerini daha erişilebilir hale getirmiştir. Bu veri kümelerinde tanımlanan varyantların patojenitesini tahmin etmek için silico algoritmalarında bir dizi siliko algoritma geliştirilmiş olsa da, fonksiyonel çalışmalar, özellikle yanlış anlama için, spesifik genomik varyantların protein fonksiyonunu nasıl etkilediğini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Türev -leri. Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı ‘nda (UDN) ve diğer nadir hastalık araştırma konsorsiyumlarında, Drosophila, C. elegans, zebra balığı ve fareler dahil olmak üzere model organizmalar (MO) aktif olarak putatif insan hastalığına neden olan fonksiyonu değerlendirmek için kullanılır Türev -leri. Bu protokol, UDN’nin Model Organizmalar Tarama Merkezi Drosophila Core’da kullanılan nadir insan varyantlarının fonksiyonel değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlamaktadır. İş akışı, birden fazla genel veritabanlarından insan ve MO bilgilerini toplamak, marrvel web kaynağını kullanarak varyantın hastanın durumuna katkıda bulunup bulunmadığını değerlendirmek ve mevcut temele dayalı etkili deneyler tasarlamak ile başlar. bilgi ve kaynaklar. Daha sonra, genetik araçlar (örneğin, T2A-GAL4 ve UAS-insan cDNA hatları) Drosophilailgi varyantlarının işlevlerini değerlendirmek için oluşturulur. Bu reaktiflerin geliştirilmesi üzerine, varyant işlevini değerlendirmek için kurtarma ve aşırı ifade deneylerine dayalı iki uçlu fonksiyonel tahliller yapılabilir. Kurtarma dalında, endojen sinek genleri referans veya varyant insan transgenleri ile ortolog Drosophila gen yerine “insancıl” vardır. Aşırı ifade dalında, referans ve varyant insan proteinleri dışsal dokuların çeşitli tahrik vardır. Her iki durumda da, herhangi bir çatlanabilir fenotip (örneğin, öldürücülük, göz morfolojisi, elektrofizyoloji) ilgi hastalığı ne olursa olsun, bir okuma olarak kullanılabilir. Referans ve varyant aleller arasında gözlenen farklılıklar varyanta özgü bir etki ve dolayısıyla büyük olasılıkla patojenite yi düşündürmektedir. Bu protokol, bilinen ve bilinmeyen işlevleri olan genlerin putatif insan hastalığına neden olan varyantlarının hızlı ve in vivo değerlendirmelerine olanak sağlar.

Introduction

Nadir hastalığı olan hastalar genellikle doğru bir tanı elde etmek için “tanı odyssey” olarak adlandırılan zorlu bir yolculuk geçmesi1. En nadir hastalıkların güçlü bir genetik kökene sahip olduğu düşünülmektedir, klinik çalışma kritik unsurları genetik / genomik analizler yapma. Aday gen paneli dizileme ve kromozom mikrodizileri, bütün ekzom (WES) ve tüm genom dizileme (WGS) teknolojileri dayalı kopya numarası varyasyon analizi ek olarak son on yıl içinde giderek daha değerli araçlar haline gelmiştir2, 3 . Şu anda, WES ve WGS bilinen bir patojenik varyant ı belirlemek için tanı oranı ~ 25% (pediatrik vakalarda daha yüksek)4,5. Klinik WES/WGS’den sonra tanı konmamış olan vakaların çoğunda, yaygın bir sorun birçok aday gen ve varyantolmasıdır. Yeni nesil sıralama genellikle birçok gende yeni veya ultra nadir varyantları tanımlar ve bu varyantların hastalık fenomenilerine katkıda bulunup bulunmadığını yorumlamak zordur. Örneğin, genlerdeki çoğu saçma veya kare kayma mutasyonunun, kodlanmış transkriptin saçma aracılı çürümesi nedeniyle fonksiyon kaybı (LOF) alelleri olduğu düşünülse de, son ekonlarda bulunan kesilen mutasyonlar bu süreçten kaçar ve iyi huylu veya fonksiyon kazancı (GOF)alel6 .

Ayrıca, yanlış algılamalı alelin etkilerini tahmin etmek yıldırıcı bir görevdir, çünkü ilk olarak Herman Muller tarafından 1930’larda (yani, amorf, hipomorf, hipermorf, antimorf, neomorf veya izomorf) açıklandığı gibi farklı genetik senaryolar bir dizi neden olabilir 7 . Evrimsel koruma, amino asit değişiminin türü, fonksiyonel etki alanı içindeki konumu, genel popülasyondaki alel frekansı, ve diğer parametreler8. Ancak, bu programlar varyant yorumlama karmaşık sorunu çözmek için kapsamlı bir çözüm değildir. İlginçtir, yeni bir çalışmada beş yaygın olarak kullanılan varyant patojenik tahmin algoritmaları (Polyphen9, SIFT10, CADD11, PROVEAN12, Mutasyon Taster) patojenite ~ 8% katılıyorum gösterdi . Özellikle, tüm algoritmalar kabul etse bile, patojenite nin %11’ine kadar yanlış bir tahminde bulunurlar. Bu sadece kusurlu klinik yorumlanmasına yol açmakla kalmıyor, aynı zamanda araştırmacıları yanlış bir şekilde iyi huylu olarak listeleyerek yeni varyantları takip etmekten caydırabilir. Silico modellemede mevcut sınırlamayı tamamlamanın bir yolu, varyant fonksiyonunun in vitro, ex vivo (örn. kültürlü hücreler, organoidler) veya in vivo etkisini gösteren deneysel veriler sağlamaktır.

MO nadir hastalık ilişkili varyantları in vivo fonksiyonel çalışmalar benzersiz güçlü13 var ve Amerika Birleşik Devletleri’nde Tanı konulmamış Hastalıklar Ağı (UDN) ve Nadir dahil olmak üzere dünya çapında birçok nadir hastalık araştırma girişimleri tarafından kabul edilmiştir Hastalıklar Modelleri ve Mekanizmaları (RDMM) Ağları Kanada, Japonya, Avrupa ve Avustralya14. MO araştırmacılarını ulusal ölçekte nadir hastalık tanısı ve mekanistik çalışmaların iş akışına entegre etmek için yapılan bu eşgüdümlü çabalara ek olarak, klinik ve MO araştırmacıları arasında yapılan bir dizi bireysel işbirliği çalışması keşfe yol açmıştır. ve birçok yeni insan hastalığı neden gen ve varyantları82,83,84karakterizasyonu .

UDN’de, merkezi bir Model Organizmalar Tarama Merkezi (MOSC) aday gen ve varyantların sunumlarını hastanın durumunun tanımıyla alır ve varyantın enformatik araçlar kullanılarak patojenik olup olmadığını değerlendirir ve in vivo Deney. UDN’nin Faz I’inde (2015-2018) MOSC, vakaları değerlendirmek için işbirliği içinde çalışan Drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] ve Zebrafish Core’dan (Oregon Üniversitesi) oluşuyordu. Drosophila ve zebrabalığı nda bilişim analizi ve farklı deneysel stratejiler bir dizi kullanarak, MOSC şimdiye kadar 132 hastanın tanısına katkıda bulunmuştur, 31 yeni sendromlar belirlenmesi55, birkaç yeni insan keşfi hastalık genleri (örneğin, EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) ve bilinen hastalığın fenotipik genişlemesi genler (örneğin, CACNA1A21, ACOX122).

MOSC Drosophila Core araştırmacıları, UDN içindeki projelere ek olarak, Mendelian Genomik Merkezleri ve diğer girişimlerle işbirliği içinde yeni hastalık gen keşiflerine katkıda bulunmuştur (örn. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, OGDHL25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, DNMBP29) bilişim ve genetik aynı seti kullanarak UDN için geliştirilen stratejiler. Nadir hastalık tanısı üzerine MO çalışmalarının önemi göz önüne alındığında, MOSC UDN Faz II (2018-2022) için bir C. elegans Core ve ikinci Zebrafish çekirdek (Her ikisi de Washington Üniversitesi’nde St Louis) içerecek şekilde genişletildi.

Bu el yazması, udn MOSC Drosophila Core’da aktif olarak kullanılan in vivo fonksiyonel çalışma protokolünü açıklar. Protein. Bu protokolün amacı, MO araştırmacılarının klinik araştırma gruplarıyla işbirliği içinde çalışarak, ilgi çeken bir gendeki bir aday varyantın fonksiyonel sonuçları olduğuna dair deneysel kanıtlar sunarak klinik tanıyı kolaylaştırmaktır. Bu protokol en çok, drosophila araştırmacısının, ilgi çeken bir gende belirli bir aday varyantı olan nadir bir hastalık hastası olan bir klinik araştırmacı tarafından yaklaşıldığı bir senaryoda yararlıdır.

Bu protokol üç unsura ayrılabilir: (1) hasta fenotip ve Drosophilafonksiyonel bir çalışmanın fizibilite sorumlu olan ilgi varyantı olasılığını değerlendirmek için bilgi toplama , (2) toplama mevcut genetik araçlar ve yenilerini kurmak ve (3) in vivo fonksiyonel çalışmalar yapmak. Üçüncü öğe, bir ilgi varyantının işlevinin nasıl değerlendirilebileceğine (kurtarma deneyi veya aşırı ifade tabanlı stratejiler) göre iki alt öğeye ayrılabilir. Bu protokolün nadir monojenik hastalık araştırmaları dışında birçok senaryoya uyarlanabildiği ve optimize edilebildiği unutulmamalıdır (örn. yaygın hastalıklar, gen-çevre etkileşimleri ve terapötik hedefleri belirlemek için farmakolojik/genetik ekranlar). Varyantların işlevselliğini ve patojenliğini belirleyebilme becerisi sadece doğru moleküler tanı sağlayarak ilgi çeken hastaya fayda sağlamakla kalmamış, aynı zamanda hem çevirisel hem de temel bilimsel araştırmalar üzerinde daha geniş etkilere de yol açacaktır.

Protocol

1. Değerlendirmek için İnsan ve MO Bilgi Toplama: Bir İlgi Varyantı Hastalık Fenotipler ve Drosophila Fonksiyonel Çalışmaların Fizibilite Sorumlu Olma Olasılığı İlgi çekici hastanın fenotipini açıklamak için belirli genve türevlerin iyi adaylar olup olmadığını belirlemek için kapsamlı veritabanı ve literatür aramaları gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki bilgileri toplayın. İlgi geninin daha önce diğer genetik bozukluklara (bilinen hast…

Representative Results

Nörogelişimsel Fenotilere Bağlı EBF3’te De novo Missense Varyantının Fonksiyonel ÇalışmasıHipotoni, ataksi, küresel gelişimsel gecikme ve anlamlı konuşma bozukluğu gibi nörogelişimsel fenotipleri olan 7 yaşındaki bir erkek, Ulusal Sağlık Enstitüleri Tanı konulmamış Hastalıklar Projesi’nde (UDP) hekimler ve insan genetikçileri EBF3’te (Erken B-Hücre Faktörü3) 15’te bir de novo missense varyantı (p.R163Q) saptandırılır…

Discussion

Drosophila melanogaster kullanarak deneysel çalışmalar hastalık la ilişkili insan varyantları sonuçlarını değerlendirmek için sağlam bir araştırma sistemi sağlar. Bu bilgi ve son yüzyılda sinek alanında birçok araştırmacı tarafından oluşturulan çeşitli genetik araçların büyük vücut kaynaklanmaktadır89. Diğer deneysel sistem gibi, ancak, var olan uyarılar ve sınırlamalar kabul etmek önemlidir.

Veri Madenciliği ile İ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jose Salazar, Julia Wang ve Dr. Karen Schulze’ye el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Dr. Ning Liu ve Xi Luo’yu burada tartışılan TBX2 varyantlarının fonksiyonel karakterizasyonu için kabul ediyoruz. Teşhis Edilemeyen Hastalıklar Ağ Modeli Organizmatarama Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ortak Fonu (U54 NS093793) aracılığıyla desteklendi. H. T. C. daha NIH [CNCDP-K12 ve NINDS (1K12 NS098482)], Amerikan Nöroloji Akademisi (Nörobilim Araştırma hibe), Burroughs Wellcome Fonu (Kariyer Ödülü Tıp Bilim Adamları için Kariyer Ödülü), Çocuk Nöroloji Derneği ve Çocuk Nöroloji Vakfı tarafından desteklendi ( PERF Elterman hibe ve NIH Direktörü Erken Bağımsızlık Ödülü (DP5 OD026426). M. F. W. simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479) tarafından daha da desteklenmiştir. S. Y. daha NIH (R01 DC014932), Simons Vakfı (SFARI Ödülü: 368479), Alzheimer Derneği (Yeni Araştırmacı Araştırma Hibe: 15-364099), Naman Aile Fonu Temel Araştırma ve Caroline Wiess Hukuk Fonu araştırma tarafından desteklendi Moleküler Tıp. BCM’de konfokal mikroskopi kısmen NIH Grant U54HD083092 tarafından Entelektüel ve Gelişimsel Engelliler Araştırma Merkezi (IDDRC) Nörogörüntüleme Çekirdeği’ne desteklenmektedir.

Materials

Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24871 Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) BDSC #24872 Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line
Plasmid DNA
Cloning vector Thermo Fisher #12536-017 Specific Reagent: pDONR221
Drosophila transgenesis vector Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) Specific Reagent: pGW-HA.attB
Molecular biology kits and reagents
Agarose Sigma-Aldrich #A2790 Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade)
Chemically Competent Cells (E. coli) Thermo Fisher #18265017 Specific Reagent: DH5α
DNA Gel Extraction kit Thermo Fisher #K210012 Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit
DNA Isolation and purification kit Qiagen #27104 Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit
High Fidelity Polymerase NEB #M0491 Specific Reagent: Q5 Polymerase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11789020 Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit
Recombinase mediated cloning system Thermo Fisher #11791100 Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit
Site Directed Mutagenesis kit Agilent #200523 Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit
Electroretinogram Rig related equipment
ERG Analysis Molecular Devices N/A Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package
ERG Data Collection LabX #R150358 Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier
ERG Stimulator Astro-Med #S48 Specific Reagent: Square Pulse Stimulator
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boycott, K. M., et al. International Cooperation to Enable the Diagnosis of All Rare Genetic Diseases. The American Journal of Human Genetics. 100 (5), 695-705 (2017).
  2. Lupski, J. R., et al. Whole-Genome Sequencing in a Patient with Charcot-Marie-Tooth Neuropathy. New England Journal of Medicine. 362 (13), 1181-1191 (2010).
  3. Boycott, K. M., Vanstone, M. R., Bulman, D. E., MacKenzie, A. E. Rare-disease genetics in the era of next-generation sequencing: discovery to translation. Nature Reviews Genetics. 14 (10), 681-691 (2013).
  4. Yang, Y., et al. Molecular Findings Among Patients Referred for Clinical Whole-Exome Sequencing. JAMA. 312 (18), 1870 (2014).
  5. Lee, H., et al. Clinical Exome Sequencing for Genetic Identification of Rare Mendelian Disorders. JAMA. 312 (18), 1880 (2014).
  6. Coban-Akdemir, Z., et al. Identifying Genes Whose Mutant Transcripts Cause Dominant Disease Traits by Potential Gain-of-Function Alleles. The American Journal of Human Genetics. 103 (2), 171-187 (2018).
  7. Muller, H. J. Further studies on the nature and causes of gene mutations. Proceedings of the Sixth International Congress of Genetics. , 213-255 (1932).
  8. Ghosh, R., Oak, N., Plon, S. E. Evaluation of in silico algorithms for use with ACMG/AMP clinical variant interpretation guidelines. Genome Biology. 18 (1), 225 (2017).
  9. Adzhubei, I. A., et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nature Methods. 7 (4), 248-249 (2010).
  10. Vaser, R., Adusumalli, S., Leng, S. N., Sikic, M., Ng, P. C. SIFT missense predictions for genomes. Nature Protocols. 11 (1), 1-9 (2016).
  11. Rentzsch, P., Witten, D., Cooper, G. M., Shendure, J. l., Kircher, M. CADD: predicting the deleteriousness of variants throughout the human genome. Nucleic Acids Research. , (2018).
  12. Choi, Y., Sims, G. E., Murphy, S., Miller, J. R., Chan, A. P. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PloS ONE. 7 (10), 46688 (2012).
  13. Wangler, M. F., et al. Model Organisms Facilitate Rare Disease Diagnosis and Therapeutic Research. Genetics. 207 (1), 9-27 (2017).
  14. Oriel, C., Lasko, P. Recent Developments in Using Drosophila as a Model for Human Genetic Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 2041 (2018).
  15. Chao, H. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  16. Oláhová, M., et al. Biallelic Mutations in ATP5F1D, which Encodes a Subunit of ATP Synthase, Cause a Metabolic Disorder. American Journal of Human Genetics. 102 (3), 494-504 (2018).
  17. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  18. Marcogliese, P. C., et al. IRF2BPL Is Associated with Neurological Phenotypes. American Journal of Human Genetics. 103 (2), 245-260 (2018).
  19. Ferreira, C. R., et al. A Recurrent De Novo Heterozygous COG4 Substitution Leads to Saul-Wilson Syndrome, Disrupted Vesicular Trafficking, and Altered Proteoglycan Glycosylation. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 553-567 (2018).
  20. Kanca, O., et al. De novo variants in WDR37 are associated with epilepsy, colobomas and cerebellar hypoplasia. Americal Journal of Human Genetics. , (2019).
  21. Luo, X., et al. Clinically severe CACNA1A alleles affect synaptic function and neurodegeneration differentially. PLOS Genetics. 13 (7), 1006905 (2017).
  22. Chung, H., et al. ACOX1 induces autoimmunity whereas a de novo gain of function variant induces elevated ROS and glial loss in humans and flies. Cell Metabolism. , (2019).
  23. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159 (1), 200-214 (2014).
  24. Jakobsdottir, J., et al. Rare Functional Variant in TM2D3 is Associated with Late-Onset Alzheimer’s Disease. PLoS Genetics. 12 (10), 1006327 (2016).
  25. Yoon, W. H., et al. Loss of Nardilysin, a Mitochondrial Co-chaperone for α-Ketoglutarate Dehydrogenase, Promotes mTORC1 Activation and Neurodegeneration. Neuron. 93 (1), 115-131 (2017).
  26. Harel, T., et al. Recurrent De Novo and Biallelic Variation of ATAD3A, Encoding a Mitochondrial Membrane Protein, Results in Distinct Neurological Syndromes. American Journal of Human Genetics. 99 (4), 831-845 (2016).
  27. Tan, K. L., et al. Ari-1 Regulates Myonuclear Organization Together with Parkin and Is Associated with Aortic Aneurysms. Developmental Cell. 45 (2), 226-244 (2018).
  28. Ansar, M., et al. Visual impairment and progressive phthisis bulbi caused by recessive pathogenic variant in MARK3. Human Molecular Genetics. 27 (15), 2703-2711 (2018).
  29. Ansar, M., et al. Bi-allelic Loss-of-Function Variants in DNMBP Cause Infantile Cataracts. The American Journal of Human Genetics. 103 (4), 568-578 (2018).
  30. Wang, J., et al. MARRVEL: Integration of Human and Model Organism Genetic Resources to Facilitate Functional Annotation of the Human Genome. The American Journal of Human Genetics. 100 (6), 843-853 (2017).
  31. Wang, J., Liu, Z., Bellen, H., Yamamoto, S. MARRVEL, a web-based tool that integrates human and model organism genomics information. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  32. Mungall, C. J., et al. The Monarch Initiative: an integrative data and analytic platform connecting phenotypes to genotypes across species. Nucleic Acids Research. 45, 712-722 (2017).
  33. Hu, Y., Comjean, A., Mohr, S. E., Perrimon, N., Perrimon, N. Gene2Function: An Integrated Online Resource for Gene Function Discovery. Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2855-2858 (2017).
  34. Ioannidis, N. M., et al. An Ensemble Method for Predicting the Pathogenicity of Rare Missense Variants. The American Journal of Human Genetics. 99 (4), 877-885 (2016).
  35. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein–protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45 (1), 362-368 (2017).
  36. Hu, Y., et al. Molecular Interaction Search Tool (MIST): an integrated resource for mining gene and protein interaction data. Nucleic Acids Research. 46 (1), 567-574 (2018).
  37. Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Research. 44 (1), 396-403 (2016).
  38. Bienert, S., et al. The SWISS-MODEL Repository-new features and functionality. Nucleic Acids Research. 45 (1), 313-319 (2017).
  39. Webb, B., Sali, A. Comparative Protein Structure Modeling Using MODELLER. Current Protocols in Bioinformatics. 54, 1-37 (2016).
  40. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).
  41. Bamshad, M. J., et al. The Centers for Mendelian Genomics: A new large-scale initiative to identify the genes underlying rare Mendelian conditions. American Journal of Medical Genetics Part A. 158 (7), 1523-1525 (2012).
  42. Sobreira, N. L. M., et al. Matchmaker Exchange. Current Protocols in Human Genetics. 95, 1-15 (2017).
  43. Temple, G., et al. The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC). Genome Research. 19 (12), 2324-2333 (2009).
  44. Katzen, F. Gateway ®Recombinational cloning: a biological operating system. Expert Opinion on Drug Discovery. 2 (4), 571-589 (2007).
  45. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  46. Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
  47. Bischof, J., Sheils, E. M., Björklund, M., Basler, K. Generation of a transgenic ORFeome library in Drosophila. Nature Protocols. 9 (7), 1607-1620 (2014).
  48. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), e1135 (2009).
  49. Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2189 (2010).
  50. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  51. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods in Molecular Biology. 561, 3-19 (2009).
  52. Venken, K. J. T., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC Transgenic Platform for Targeted Insertion of Large DNA Fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  53. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  54. Greenspan, R. . Fly Pushing: The Thory and Practice of Drosophila Genetics. , (2004).
  55. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2005).
  56. Diao, F., White, B. H. A Novel Approach for Directing Transgene Expression in Drosophila: T2A-Gal4 In-Frame Fusion. Genetics. 190 (3), 1139-1144 (2012).
  57. Diao, F., et al. Plug-and-Play Genetic Access to Drosophila Cell Types using Exchangeable Exon Cassettes. Cell Reports. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  58. Bellen, H. J., et al. The Drosophila Gene Disruption Project: Progress Using Transposons With Distinctive Site Specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  59. Lee, P. -. T., et al. A gene-specific T2A-GAL4 library for Drosophila. eLife. 7, (2018).
  60. Venken, K. J. T., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nature Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
  61. Li-Kroeger, D., et al. An expanded toolkit for gene tagging based on MiMIC and scarless CRISPR tagging in Drosophila. eLife. 7, (2018).
  62. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  63. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit Flies in Biomedical Research. Genetics. 199 (3), 639-653 (2015).
  64. Duffy, J. B. GAL4 system indrosophila: A fly geneticist’s swiss army knife. Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  65. Nagarkar-Jaiswal, S., et al. A library of MiMICs allows tagging of genes and reversible, spatial and temporal knockdown of proteins in Drosophila. eLife. 4, (2015).
  66. Dolph, P., Nair, A., Raghu, P. . Electroretinogram Recordings of Drosophila. (1), (2011).
  67. Lauwers, E., Verstreken, P. Assaying Mutants of Clathrin-Mediated Endocytosis in the Fly Eye. Methods in Molecular Biology. 1847, 109-119 (2018).
  68. Rhodes-Mordov, E., Samra, H., Minke, B. Electroretinogram (ERG) Recordings from Drosophila. Bio-Protocol. 5 (21), (2015).
  69. Deal, S., Yamamoto, S. Unraveling novel mechanisms of neurodegeneration through a large-scale forward genetic screen in Drosophila. Frontiers in Genetics. , (2019).
  70. Chouhan, A. K., et al. Uncoupling neuronal death and dysfunction in Drosophila models of neurodegenerative disease. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), 62 (2016).
  71. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  72. Liberg, D., Sigvardsson, M., Akerblad, P. The EBF/Olf/Collier family of transcription factors: regulators of differentiation in cells originating from all three embryonal germ layers. Molecular and Cellular Biology. 22 (24), 8389-8397 (2002).
  73. Prasad, B. C., et al. Unc-3, a gene required for axonal guidance in Caenorhabditis elegans, encodes a member of the O/E family of transcription factors. Development. 125 (8), 1561-1568 (1998).
  74. Jinushi-Nakao, S., et al. Knot/Collier and Cut Control Different Aspects of Dendrite Cytoskeleton and Synergize to Define Final Arbor Shape. Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).
  75. Pozzoli, O., Bosetti, A., Croci, L., Consalez, G. G., Vetter, M. L. Xebf3 is a regulator of neuronal differentiation during primary neurogenesis in Xenopus. Developmental Biology. 233 (2), 495-512 (2001).
  76. Wang, S. S., Lewcock, J. W., Feinstein, P., Mombaerts, P., Reed, R. R. Genetic disruptions of O/E2 and O/E3 genes reveal involvement in olfactory receptor neuron projection. Development. 131 (6), 1377-1388 (2004).
  77. Fulp, C. T., et al. Identification of Arx transcriptional targets in the developing basal forebrain. Human Molecular Genetics. 17 (23), 3740-3760 (2008).
  78. Gécz, J., Cloosterman, D., Partington, M. ARX: a gene for all seasons. Current Opinion in Genetics & Development. 16 (3), 308-316 (2006).
  79. Dubois, L., Vincent, A. The COE–Collier/Olf1/EBF–transcription factors: structural conservation and diversity of developmental functions. Mechanisms of Development. 108 (1-2), 3-12 (2001).
  80. Cook, R. K., et al. The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome. Genome Biology. 13 (3), 21 (2012).
  81. Chao, H. -. T., et al. A Syndromic Neurodevelopmental Disorder Caused by De Novo Variants in EBF3. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 128-137 (2017).
  82. Sleven, H., et al. De Novo Mutations in EBF3 Cause a Neurodevelopmental Syndrome. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 138-150 (2017).
  83. Harms, F. L., et al. Mutations in EBF3 Disturb Transcriptional Profiles and Cause Intellectual Disability, Ataxia, and Facial Dysmorphism. The American Journal of Human Genetics. 100 (1), 117-127 (2017).
  84. Tanaka, A. J., et al. De novo variants in EBF3 are associated with hypotonia, developmental delay, intellectual disability, and autism. Molecular Case Studies. 3 (6), 002097 (2017).
  85. Blackburn, P. R., et al. Novel de novo variant in EBF3 is likely to impact DNA binding in a patient with a neurodevelopmental disorder and expanded phenotypes: patient report, in silico functional assessment, and review of published cases. Molecular Case Studies. 3 (3), 001743 (2017).
  86. Lopes, F., Soares, G., Gonçalves-Rocha, M., Pinto-Basto, J., Maciel, P. Whole Gene Deletion of EBF3 Supporting Haploinsufficiency of This Gene as a Mechanism of Neurodevelopmental Disease. Frontiers in Genetics. 8, 143 (2017).
  87. Liu, N., et al. Functional variants in TBX2 are associated with a syndromic cardiovascular and skeletal developmental disorder. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2454-2465 (2018).
  88. Mesbah, K., et al. Identification of a Tbx1/Tbx2/Tbx3 genetic pathway governing pharyngeal and arterial pole morphogenesis. Human Molecular Genetics. 21 (6), 1217-1229 (2012).
  89. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163 (1), 12-14 (2015).
  90. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine. 17 (5), 405-423 (2015).
  91. McGary, K. L., Park, T. J., Woods, J. O., Cha, H. J., Wallingford, J. B., Marcotte, E. M. Systematic discovery of nonobvious human disease models through orthologous phenotypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (14), 6544-6549 (2010).
  92. Yamamoto, S., et al. A Drosophila Genetic Resource of Mutants to Study Mechanisms Underlying Human Genetic Diseases. Cell. 159, 200-214 (2014).
  93. Ausubel, F. M. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1989).
  94. Rubin, G., Spradling, A. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  95. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A Quick, Cost-Free Method of Purification of DNA Fragments from Agarose Gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  96. Ronaghi, M. DNA Sequencing :A Sequencing Method Based on Real-Time Pyrophosphate. Science. 281 (5375), 363-365 (1998).
  97. Ho, S. N., Hunt, H. D., Horton, R. M., Pullen, J. K., Pease, L. R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 77 (1), 51-59 (1989).

Tags

DrosophilaIn Vivo Functional StudyRare Human VariantsDisease-associated VariantsProtein FunctionRescue ExperimentsOverexpression StudiesGal4-UAS SystemVisual SystemPhotoreceptors

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Harnish, J. M., Deal, S. L., Chao, H., Wangler, M. F., Yamamoto, S. In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila. J. Vis. Exp. (150), e59658, doi:10.3791/59658 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image