In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Patiënten met zeldzame ziekten ondergaan vaak een moeizame reis die wordt aangeduid als de “diagnostische Odyssee” om een accurate diagnose¹te verkrijgen. De meeste zeldzame ziekten worden verondersteld te hebben een sterke genetische oorsprong, het maken van genetische/genomic analyseert kritische elementen van de klinische werk. In aanvulling op de kandidaat-genpanel sequencing en de Copy Number variatie-analyse op basis van chromosomale micro arrays, zijn whole-exome (WES) en Whole-genoom sequencing (WGS)-technologieën steeds meer waardevolle hulpmiddelen geworden in de afgelopen tien jaar^{2, 3}. Momenteel is de diagnostische snelheid voor het identificeren van een bekende pathogene variant in Wes en WGS ~ 25% (hoger in pediatrische gevallen)^4,5. Voor de meeste gevallen die niet gediagnosticeerd blijven na klinische WES/WGS, is een veelvoorkomend probleem dat er veel kandidaatgenen en varianten zijn. Volgende-generatie sequencing identificeert vaak nieuwe of ultra-zeldzame varianten in veel genen, en het interpreteren of deze varianten bijdragen aan de ziekte fenotypes is uitdagend. Hoewel de meeste onzin-of frame Shift-mutaties in genen worden beschouwd als verlies van functie (LOF) allelen als gevolg van nonsens-gemedieerde verval van de gecodeerde transcriptie, kunnen afslankende mutaties die in de laatste exonen zijn gevonden, aan dit proces ontsnappen en functioneren als goedaardig of gain-of-function (GoF) allelen⁶.

Bovendien, het voorspellen van de effecten van een missense allel is een lastige taak, omdat het kan resulteren in een aantal verschillende genetische scenario’s zoals voor het eerst beschreven door Herman Muller in de jaren 1930 (dat wil zeggen, amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, Neomorph, of Isomorph)⁷ . Talrijke in silico-Programma’s en methodologieën zijn ontwikkeld om de pathogeniteit van missense-varianten te voorspellen op basis van evolutionaire instandhouding, type aminozuur verandering, positie binnen een functioneel domein, allel-frequentie in de algemene populatie, en andere parameters⁸. Deze Programma’s zijn echter geen allesomvattende oplossing voor het oplossen van het gecompliceerde probleem van de interpretatie van varianten. Interessant is dat een recente studie heeft aangetoond dat vijf algemeen gebruikte voorspellend voorspelling van varianten (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, Cadd¹¹, Provean¹², mutatie taster) overeenkomen met pathogeniteit ~ 80% van de tijd⁸ . Met name, zelfs wanneer alle algoritmen het erover eens zijn, geven ze een onjuiste voorspelling van pathogeniteit tot 11% van de tijd. Dit leidt niet alleen tot gebrekkige klinische interpretatie, maar kan ook onderzoekers ontmoedigen om nieuwe varianten op te volgen door ze onterecht als goedaardig te vermelden. Een manier om de huidige beperking van in silico-modellering aan te vullen, is om experimentele gegevens te leveren die het effect van de variant functie in vitro, ex vivo (bijv. gekweekte cellen, organoïden) of in vivo aantonen.

In vivo functionele studies van zeldzame ziekten geassocieerde varianten in MO hebben unieke sterktes¹³ en zijn goedgekeurd door vele zeldzame ziekte onderzoek initiatieven over de hele wereld, met inbegrip van de niet-gediagnosticeerde ziekten netwerk (UDN) in de Verenigde Staten en zeldzame Ziekten modellen & mechanismen (RDMM) netwerken in Canada, Japan, Europa en Australië¹⁴. Naast deze gecoördineerde inspanningen om MO-onderzoekers te integreren in de workflow voor diagnose van zeldzame ziekten en mechanistische studies op nationale schaal, hebben een aantal individuele samenwerkings onderzoeken tussen klinische en MO-onderzoekers geleid tot de ontdekking en karakterisering van vele nieuwe genen en varianten van de menselijke ziekte,^82,83,84.

In het UDN ontvangt een gecentraliseerd model organismen screening Center (MOSC) inzendingen van kandidaatgenen en varianten met een beschrijving van de toestand van de patiënt en beoordeelt zij of de variant waarschijnlijk pathogeen is met informatica-instrumenten en in vivo Experimenten. In fase I (2015-2018) van het UDN bestond de MOSC uit een Drosophila kern [Baylor College of Medicine (BCM)] en Zebrafish core (University of Oregon) die samen werkten om gevallen te beoordelen. Met behulp van informatica analyse en een aantal verschillende experimentele strategieën in Drosophila en zebravis heeft de MOSC tot nu toe bijgedragen aan de diagnose van 132 patiënten, identificatie van 31 nieuwe syndromen⁵⁵, ontdekking van verschillende nieuwe menselijke ziekte genen (bijv. EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) en fenotypische expansie van bekende ziekten genen (bijv. CACNA1A²¹, ACOX1²²).

Naast projecten binnen het UDN hebben de kern onderzoekers van MOSC Drosophila bijgedragen aan nieuwe ziekteverwekkende genen in samenwerking met de centra voor Mendelian Genomics en andere initiatieven (bijv. ANKLE2²³, TM2D3 ²⁴, NRD1²⁵, ogdhl²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, dnmbp²⁹) met dezelfde verzameling van informatica en genetische strategieën ontwikkeld voor het UDN. Gezien het belang van MO-studies over de diagnose van zeldzame ziekten, werd de MOSC uitgebreid met een C. elegans core en Second Zebrafish core (beide aan de Washington University in St. Louis) voor fase II (2018-2022) van het UDN.

Dit manuscript beschrijft een in vivo functioneel studie protocol dat actief wordt gebruikt in de UDN MOSC Drosophila core om te bepalen of missense varianten functionele gevolgen hebben voor het proteïne van belang met behulp van transgene vliegen die menselijke Eiwitten. Het doel van dit protocol is om MO-onderzoekers te helpen samen te werken met klinische onderzoeksgroepen om experimenteel bewijs te leveren dat een kandidaatvariant in een gen van belang functionele gevolgen heeft, waardoor de klinische diagnose wordt vergemakkelijkt. Dit protocol is vooral nuttig in een scenario waarin een onderzoeker van Drosophila wordt benaderd door een klinisch onderzoeker die een patiënt met een zeldzame ziekte heeft met een specifieke kandidaatvariant in een gen van belang.

Dit protocol kan worden onderverdeeld in drie elementen: (1) het verzamelen van informatie om de waarschijnlijkheid te beoordelen van de variant van de rente die verantwoordelijk is voor het fenotype van de patiënt en de haalbaarheid van een functioneel onderzoek in Drosophila, (2) het verzamelen bestaande genetische hulpmiddelen en het oprichten van nieuwe, en (3) het uitvoeren van functionele studies in vivo. Het derde element kan verder worden onderverdeeld in twee sub-elementen, gebaseerd op hoe de functie van een variant van belang kan worden beoordeeld (reddingsexperiment of overexpressie gebaseerde strategieën). Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan worden aangepast en geoptimaliseerd voor vele scenario’s buiten zeldzame monogene ziekte onderzoek (bijvoorbeeld, gemeenschappelijke ziekten, gen-omgeving interacties, en farmacologische/genetische schermen om therapeutische doelen te identificeren). De mogelijkheid om de functionaliteit en pathogeniteit van varianten te bepalen zal niet alleen de patiënt van belang ten goede komen door een accurate moleculaire diagnose te geven, maar zal ook bredere effecten hebben op zowel translationeel als fundamenteel wetenschappelijk onderzoek.