Étude fonctionnelle In Vivo des variantes humaines rares associées à la maladie utilisant la drosophile

Les patients atteints de maladies rares subissent souvent un voyage ardu appelé « odyssée diagnostique » pour obtenir un diagnostic précis¹. On pense que la plupart des maladies rares ont une forte origine génétique, ce qui rend les analyses génétiques/génomiques des éléments critiques de la prise de contrôle clinique. En plus du séquençage des panneaux génétiques candidats et de l’analyse de la variation des nombres de copies basée sur les microréseaux chromosomiques, les technologies de séquençage du génome entier (WGS) sont devenues des outils de plus en plus précieux au cours de la dernière décennie^{2, 3}. À l’heure actuelle, le taux de diagnostic pour l’identification d’une variante pathogène connue dans WES et WGS est de 25 % (plus élevé dans les cas pédiatriques)^4,5. Pour la plupart des cas qui restent non diagnostiqués après le WES/WGS clinique, un problème commun est qu’il y a beaucoup de gènes et de variantes de candidat. Le séquençage de nouvelle génération identifie souvent des variantes nouvelles ou ultra-rares dans de nombreux gènes, et il est difficile d’interpréter si ces variantes contribuent aux phénotypes de la maladie. Par exemple, bien que la plupart des mutations absurdes ou de changement d’image dans les gènes soient considérées comme des allèles de perte de fonction (LOF) en raison de la désintégration non-écrite de la transcription codée, les mutations tronquantes trouvées dans les derniers exons échappent à ce processus et peuvent fonctionner comme alleles bénins ou de gain de fonction (GOF)⁶.

En outre, prédire les effets d’un allèle de mauvais sens est une tâche intimidante, car il peut entraîner un certain nombre de scénarios génétiques différents comme décrit pour la première fois par Herman Muller dans les années 1930 (c.-à-d., amorphe, hypomorphe, hypermorphe, antimorphe, néomorphe, ou isomorphe)⁷ . De nombreux programmes et méthodologies silico ont été développés pour prédire la pathogénicité des variantes de mauvais sens basées sur la conservation évolutive, le type de changement d’acide aminé, la position dans un domaine fonctionnel, la fréquence d’allèle dans la population générale, et d’autres paramètres⁸. Cependant, ces programmes ne sont pas une solution complète pour résoudre le problème complexe de l’interprétation des variantes. Fait intéressant, une étude récente a démontré que cinq algorithmes de prédiction de la pathogène variante largement utilisés (Polyphen⁹, SIFT¹⁰, CADD¹¹, PROVEAN¹², Mutation Taster) s’accordent sur la pathogénicité 80 % du temps⁸ . Notamment, même lorsque tous les algorithmes sont d’accord, ils renvoient une prédiction erronée de la pathogénicité jusqu’à 11% du temps. Ceci mène non seulement à l’interprétation clinique défectueuse mais peut également dissuader des chercheurs de suivre vers le haut de nouvelles variantes en les énumérant faussement comme bénins. Une façon de compléter la limitation actuelle de la modélisation silico est de fournir des données expérimentales qui démontrent l’effet de la fonction de variante in vitro, ex vivo (par exemple, les cellules cultivées, les organoïdes), ou in vivo.

Les études fonctionnelles in vivo des variantes associées aux maladies rares dans MO ont des forces uniques¹³ et ont été adoptées par de nombreuses initiatives de recherche sur les maladies rares à travers le monde, y compris le Réseau des maladies non diagnostiquées (UDN) aux États-Unis et Rare Diseases Models and Mechanisms (RDMM) Networks in Canada, Japan, Europe, and Australia¹⁴. En plus de ces efforts coordonnés visant à intégrer les chercheurs de MO dans le flux de travail du diagnostic des maladies rares et des études mécanistes à l’échelle nationale, un certain nombre d’études individuelles en collaboration entre les chercheurs cliniques et les chercheurs de MO ont mené à la découverte et la caractérisation de nombreux nouveaux gènes et variantes pathogènes^82,83,84.

Dans l’UDN, un centre centralisé de dépistage des organismes modèles (MOSC) reçoit des soumissions de gènes et de variantes candidats avec une description de l’état du patient et évalue si la variante est susceptible d’être pathogène à l’aide d’outils informatiques et in vivo Expériences. Dans la phase I (2015-2018) de l’UDN, le MOSC composé d’un drosophila Core [Baylor College of Medicine (BCM)] et Zebrafish Core (University of Oregon) qui a travaillé en collaboration pour évaluer les cas. En utilisant l’analyse informatique et un certain nombre de stratégies expérimentales différentes dans la drosophile et le poisson zèbre, le MOSC a jusqu’à présent contribué au diagnostic de 132 patients, l’identification de 31 nouveaux syndromes⁵⁵, la découverte de plusieurs nouveaux humains gènes de la maladie (par exemple, EBF3¹⁵, ATP5F1D¹⁶, TBX2¹⁷, IRF2BPL¹⁸, COG4¹⁹, WDR37²⁰) et l’expansion phénotypique de la maladie connue (p. ex., CACNA1A²¹,ACOX1²²).

En plus des projets au sein de l’UDN, les chercheurs du MOSC Drosophila Core ont contribué à de nouvelles découvertes de gènes pathogènes en collaboration avec les Centers for Mendelian Genomics et d’autres initiatives (p. ex. ANKLE2²³, TM2D3 ²⁴, NRD1²⁵, OGDHL²⁵, ATAD3A²⁶, ARIH1²⁷, MARK3²⁸, DNMBP²⁹) en utilisant le même ensemble d’informatique et de génétique stratégies développées pour l’UDN. Compte tenu de l’importance des études de MO sur le diagnostic des maladies rares, le MOSC a été élargi pour inclure un noyau de C. elegans et un deuxième noyau de poisson zèbre (tous deux à l’Université de Washington à St. Louis) pour la phase II (2018-2022) de l’UDN.

Ce manuscrit décrit un protocole d’étude fonctionnel in vivo qui est activement utilisé dans le noyau d’ODN MOSC Drosophila pour déterminer si les variantes de mauvais sens ont des conséquences fonctionnelles sur la protéine d’intérêt à l’aide de mouches transgéniques qui expriment l’homme Protéines. L’objectif de ce protocole est d’aider les chercheurs de MO à travailler en collaboration avec des groupes de recherche clinique afin de fournir des preuves expérimentales qu’une variante candidate d’un gène d’intérêt a des conséquences fonctionnelles, facilitant ainsi le diagnostic clinique. Ce protocole est le plus utile dans un scénario dans lequel un chercheur de Drosophila est approché par un chercheur clinique qui a un patient rare de maladie avec une variante spécifique de candidat dans un gène d’intérêt.

Ce protocole peut être divisé en trois éléments : (1) la collecte d’informations pour évaluer la probabilité que la variante d’intérêt soit responsable du phénotype du patient et la faisabilité d’une étude fonctionnelle dans Drosophila, (2) la collecte d’outils génétiques existants et d’en établir de nouveaux, et (3) d’effectuer des études fonctionnelles in vivo. Le troisième élément peut en outre être subdivisé en deux sous-éléments en fonction de la façon dont la fonction d’une variante d’intérêt peut être évaluée (expérience de sauvetage ou stratégies basées sur la surexpression). Il est important de noter que ce protocole peut être adapté et optimisé à de nombreux scénarios en dehors de la recherche sur les maladies monogéniques rares (p. ex., maladies courantes, interactions gènes-environnement et écrans pharmacologiques/génétiques pour identifier des cibles thérapeutiques). La capacité de déterminer la fonctionnalité et la pathogénicité des variantes profitera non seulement au patient d’intérêt en fournissant un diagnostic moléculaire précis, mais aura également des impacts plus larges sur la recherche scientifique translationnelle et fondamentale.