Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Patojen organizmaların Fitness ve virulinin değerlendirilmesi Mikrobiyoloji araştırmalarının temel bir özelliğidir. Bu karşılaştırmalar suşları veya mutasyona uğramış organizmalar arasında yapılması için, hangi araştırmacılar belirli koşullarda belirli genlerin önemini belirlemek için izin verir. Geleneksel olarak, virülans değerlendirmesi farklı bakteriyel suşları kullanarak enfeksiyon bir hayvan modeli kullanır ve enfekte hayvanın sonucunu gözlemlemek (örneğin bulaşıcı doz₅₀, ölümcül doz₅₀, ölüm zamanı, belirti şiddeti, eksikliği Belirtiler, vb.). Bu prosedür, virulence değerli açıklamaları sağlar, ancak vahşi türde varyasyonları algılamak için sonuçlar önemli farklılıklar neden suşları gerektirir. Ayrıca, sonuçlar yarı niceliksel çünkü hastalık ilerlemesi ve semptom şiddeti zaman içinde subjektif olarak niceleyilebilir, vahşi türe kıyasla virülans yorumu daha niteliksel (yani daha fazla, daha az veya eşit derecede virlan). Hayvan infeksiyonunun gerçekleştirilmesi için ortak bir alternatif, rekabetçi Endeksleri (BDT), doğrudan Fitness ya da bir gerinlik virülans karma bir enfeksiyon bir vahşi tip mevkidaşı karşılaştırmak değerleri oluşturmak için¹. Bu teknik, vahşi tip bir gerinim için virülans standardizasyon ve zayıflatma derecesini yansıtacak şekilde ölçülebilir bir değer belirleme tarafından enfeksiyon geleneksel hayvan modeli üzerinde sayısız avantajları vardır. Bu teknik, iptal edilmiş bir rekabetçi Endeks (COı)²belirlenerek bakterilerde gen etkileşimlerini analiz etmek için de adapte edilebilir. Bir COI ‘nin bir grup mutasyona uğramış organizmalar için hesaplanması, araştırmacılar iki genin bağımsız olarak patogeneze katkıda bulunup bulunmadığını ya da aynı virülans yoluna katılıp birbirlerine bağımlı olup olmadığını belirlemesine olanak tanır. Ayrıca, bir CI hesaplanması, organizmaların patogenezine değerli Öngörüler sağlayan bakterilerin numaralandırılmasını gerektirir. BDT ve COIs de araştırmacılar klinik hastalığa neden olmayan ama hala Fitness farklılıkları var avirlan suşları asses izin. Bu teknik, suşları tanımlamak için geleneksel antibiyotik direnci belirteçlerinin kullanımı ile sınırlıdır, böylece giriş suşlarının sayısını aynı anda sadece bir ya da iki kez sınırlandırır. Bu sınırlama nedeniyle, çok sayıda deneysel grup ve çoğaltır gereklidir, bu da işçilik ve malzeme maliyetlerine ilaveye ek olarak, deneysel koşullarda değişkenlik ve hatalı sonuçlar için fırsatları da arttırır. (Virulence, Fitness ve gen etkileşimlerini incelemek için karışık enfeksiyonlar kullanmanın faydaları ve uygulamalarının kapsamlı bir gözden geçirilmesi için, bkz: CR Beuzón ve D.W. Holden ¹)

Akış cytometri^3,4,5ile niceli floresan etiketli hücrelerin kullanımı gibi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için girişimleri yapılmıştır. Bu teknik, 1 ‘ i kullanarak hücreleri ölçülebilir) fenotipik işaretçileri veya 2) endojenously üretilen floresan proteinleri etiketli antikorlar. Etiketli antikorların kullanımı 1.000 hücre/mL algılama sınırı vardır ve bu nedenle³analiz etmek için hücre yüksek sayıda gerektirir. Floresan proteinlerini ifade eden hücreler değiştirilmiş bir fizyolojisine sahiptir ve yüksek protein ifadesi⁶‘ dan kaynaklanan Fitness değişikliklerine duyarlıdır. Her iki yöntem de Akış sitometrisi kullanılarak algılanabilir floresan belirteçleri sayısı ile sınırlıdır. Bir duvar modeli⁷‘ de 1.000 suşlarının ilk karma enfeksiyonundan 120 suşlarında zayıflama tespit eden bir Mikroarray tekniğinin gelişimi ile moleküler ölçüte bir gelişme elde edildi. Bu teknik, sonuç olarak önemli değişkenlik sağlayan mutasyona uğramış suşlarından RNA ‘nın Mikroarray analizini kullandı.  Yine de, karışık enfeksiyonların büyük havuzları yararlı bir araç olabilir ve hassas algılama teknikleri kullanarak, bakteriyel virülans farklılıkları tespit edilebilir kuruldu. Yeni nesil sıralamanın geliştirilmesi ile, TN-Seq transpozon mutasyonların yardımcı programını genişletti ve rasgele mutasyona uğramış bakteri ölçümü için güçlü bir yöntem sağlayan^{8,9,10, 11}‘ den itibaren. Alternatif bir protokol son zamanlarda Transpozonlar ihtiyacını ortadan kaldırır ve bunun yerine daha kolay tanımlamak ve genomik değişiklikleri ve fitness üzerindeki etkilerini izlemek için DNA barkodları kullanır geliştirilmiştir¹². Bu teknoloji büyük bir ilerlemedir, ancak genomik barkodların eklenmesi hala rasgele bir süreçtir. Önceki deneylerin rastgele üstesinden gelmek için, Yoon et al. bakterilerin kromozomları üzerinde kesin yerlere yerleştirilen benzersiz DNA barkodları kullanarak Salmonella suşlarının BDT ‘sını hesaplamak için bir yöntem geliştirdi¹³. Benzersiz barkodlu suşlar, SYBR yeşil ve her benzersiz barkodan spesifik astar içeren qPCR tabanlı bir yöntem kullanılarak saptandı. Bu teknik, qPCR ‘den önceki iç içe-PCR ihtiyacının kanıtlandığı primer verimlilikler ve düşük hassasiyette farklılıklar da dahil olmak üzere KSC tarafından uygulanan kısıtlamalarla sınırlıdır. Yine de bu yaklaşım, hedeflenen genomik değişikliklerin, birden fazla bakteriyel suşların havuzlarını tespit etmek ve potansiyel olarak ölçmek için yararlanabileceğini göstermiştir.

Aşağıdaki protokolde, son derece hassas bir dijital PCR tekniği kullanarak büyük karışık inokula havuzları ve ardından doğru ölçüte sahip bakteriyel rekabet denemeleri yapmak için yeni bir metodoloji tarif ediyoruz. Protokol, kromozom bir zararsız bölgeye yerleştirilen benzersiz bir DNA barkod ile genetik etiketleme bakteriyel suşları içerir. Bu değişiklik suşları hızlı ve doğru geleneksel seri seyreltme yerine modern moleküler teknoloji kullanarak nicelik sağlar, yineleme kaplama, ve fenotipik belirteçler (yani antibiyotik direnci güveniyor koloninin şekillendirme birimleri sayma ). Değişiklikler, tek bir havuza alınan inokulum içinde birçok suşların eşzamanlı değerlendirilmesi için izin, önemli ölçüde tüm suşları tam aynı koşullara maruz çünkü deneysel değişkenlik olasılığını azaltır. Ayrıca bu teknik Salmonella enterica serovar typhimurium ‘da geliştirilirken, herhangi bir genetik olarak kötü hale gelebilen organizmaya ve doğru bakteriyel sayılarının gerekli olduğu neredeyse her deneysel tasarıma son derece uyarlanabilir, yeni bir önceki yöntemlerle uygulanan kısıtlamalar olmadan Mikrobiyoloji laboratuvarlarında doğruluğu ve verimi artırmak için bir araçtır.