Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Die Beurteilung von Fitness und Virulenz pathogener Organismen ist ein grundlegender Aspekt der mikrobiologischen Forschung. Es ermöglicht Vergleiche zwischen Stämmen oder zwischen mutierten Organismen, was es Forschern ermöglicht, die Bedeutung bestimmter Gene unter bestimmten Bedingungen zu bestimmen. Traditionell nutzt die Virulenzbewertung ein tierisches Infektionsmodell mit verschiedenen Bakterienstämmen und beobachtet das Ergebnis des infizierten Tieres (z. B. Infektiöse Dosis₅₀, Tödliche Dosis₅₀, Zeit bis zum Tod, Symptomschwere, Symptome usw.). Dieses Verfahren liefert wertvolle Beschreibungen der Virulenz, erfordert jedoch, dass Stämme erhebliche Unterschiede in den Ergebnissen verursachen, um Variationen vom Wildtyp zu erkennen. Darüber hinaus sind die Ergebnisse semiquantitativ, da die Krankheitsprogression und die Symptomschwere im Laufe der Zeit subjektiv quantifiziert werden können, die Interpretation der Virulenz im Vergleich zum Wildtyp qualitativer ist (d. h. mehr, weniger oder gleich virulent). Eine häufige Alternative zur Durchführung von Tierinfektivitätstests besteht darin, wettbewerbsfähige Indizes (CIs) zu generieren, Werte, die Die Fitness oder Virulenz eines Stammes direkt mit einem Wildtyp-Gegenstück in einer gemischten Infektion vergleichen¹. Diese Technik hat zahlreiche Vorteile gegenüber einem traditionellen Tiermodell der Infektion, indem sie Virulenz auf einen Wildstamm standardisiert und einen quantifizierbaren Wert bestimmt, der den Grad der Dämpfung widerspiegelt. Diese Technik kann auch angepasst werden, um Genwechselwirkungen in Bakterien zu analysieren, indem ein aufgehobener Wettbewerbsindex (COI)²ermittelt wird. Die Berechnung eines COI für eine Gruppe mutierter Organismen ermöglicht es den Forschern zu bestimmen, ob zwei Gene unabhängig voneinander zur Pathogenese beitragen oder ob sie an demselben Virulenzweg beteiligt und voneinander abhängig sind. Darüber hinaus erfordert die Berechnung eines CI die Aufzählung von Bakterien, die wertvolle Einblicke in die Pathogenese von Organismen liefern können. CIs und COIs ermöglichen es Forschern auch, avirulente Stämme zu asses, die keine klinischen Krankheiten verursachen, aber immer noch Unterschiede in der Fitness haben. Diese Technik wird durch die Verwendung von traditionellen Antibiotikaresistenzmarkern zur Identifizierung von Stämmen eingeschränkt, wodurch die Anzahl der Eingangsstämme auf jeweils nur ein oder zwei begrenzt wird. Aufgrund dieser Einschränkung sind eine große Anzahl von experimentellen Gruppen und Replikationen erforderlich, was neben der Erhöhung der Arbeits- und Materialkosten auch die Chancen für Variabilität unter experimentellen Bedingungen und ungenaue Ergebnisse erhöht. (Für eine gründliche Überprüfung der Vorteile und Anwendungen der Verwendung von gemischten Infektionen zur Untersuchung von Virulenz, Fitness, und Gen-Wechselwirkungen, siehe C.R. Beuzén und D.W. Holden ¹)

Es wurde versucht, diese Einschränkung zu überwinden, wie z. B. die Verwendung fluoreszierend markierter Zellen, die über die Durchflusszytometrie^3,4,5quantifiziert werden. Diese Technik quantifiziert Zellen mit entweder 1) markierten Antikörpern gegen phänotypische Marker oder 2) endogen produzierten fluoreszierenden Proteinen. Die Verwendung von markierten Antikörpern hat eine Nachweisgrenze von 1.000 Zellen/ml und erfordert daher eine hohe Anzahl von Zellen, um³zu analysieren. Zellen, die fluoreszierende Proteine exezieren, haben eine veränderte Physiologie und sind anfällig für Fitnessveränderungen infolge einer hohen Proteinexpression⁶. Beide Methoden sind durch die Anzahl der fluoreszierenden Marker begrenzt, die mit Derdurchflusszytometrie nachweisbar sind. Ein Fortschritt in der molekularen Quantifizierung wurde durch die Entwicklung einer Mikroarray-Technik erreicht, die Dämpfung in 120 Stämmen aus einer anfänglichen gemischten Infektion von über 1.000 Stämmen in einem murinen Modell⁷erkannte. Diese Technik nutzte eine Mikroarray-Analyse von RNA aus mutierten Stämmen, die zu einer erheblichen Variabilität des Ergebnisses führten.  Dennoch stellte sie fest, dass große Pools gemischter Infektionen ein nützliches Werkzeug sein können und dass durch den Einsatz empfindlicher Nachweistechniken Unterschiede in der bakteriellen Virulenz identifiziert werden können. Mit der Entwicklung der Sequenzierung der nächsten Generation erweiterte Tn-seq den Nutzen von Transposonmutationen und ermöglichte eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Bakterien, die nach dem Zufallsprinzip mutiert waren^{8,9,10, 11}. Kürzlich wurde ein alternatives Protokoll entwickelt, das Transposons überflüssig macht und stattdessen DNA-Barcodes verwendet, um genomische Veränderungen und ihre Auswirkungen auf die Fitness leichter zu identifizieren und zu verfolgen¹². Diese Technologie ist ein großer Fortschritt, aber das Einfügen der genomischen Barcodes ist immer noch ein zufälliger Prozess. Um die Zufälligkeit früherer Experimente zu überwinden, entwickelten Yoon et al. eine Methode zur Berechnung der CIs von Salmonellenstämmen mithilfe einzigartiger DNA-Barcodes, die an präzisen Stellen auf den Chromosomen von Bakterien eingefügt wurden¹³. Einzigartige Barcode-Stämme wurden mit einer qPCR-basierten Methode mit SYBR-Grün und Primern, die für jeden eindeutigen Barcode spezifisch sind, erkannt. Die Technik wurde durch die von qPCR auferlegten Einschränkungen eingeschränkt, einschließlich Unterschieden in der Primer-Effizienz und der geringen Empfindlichkeit, was durch die Notwendigkeit von geschachtelter PCR vor qPCR belegt wird. Dennoch zeigte dieser Ansatz, dass gezielte genomische Modifikationen für den Nachweis und die potentielle Quantifizierung von Pools mehrerer Bakterienstämme genutzt werden könnten.

Im folgenden Protokoll beschreiben wir eine neuartige Methodik zur Durchführung bakterieller Wettbewerbsexperimente mit großen Pools gemischter Inocula, gefolgt von einer genauen Quantifizierung mit einer hochsensiblen digitalen PCR-Technik. Das Protokoll beinhaltet die genetische Kennzeichnung von Bakterienstämmen mit einem einzigartigen DNA-Barcode, der auf eine harmlose Region des Chromosoms eingefügt wird. Diese Modifikation ermöglicht eine schnelle und genaue Quantifizierung von Stämmen mithilfe moderner molekularer Technologie anstelle herkömmlicher serieller Verdünnungen, Nachahmung und Zählen von Koloniebildenden Einheiten, die auf phänotypischen Markern basieren (d. h. Antibiotikaresistenz ). Die Modifikationen ermöglichen die gleichzeitige Bewertung vieler Stämme in einem einzigen gepoolten Inokulum, wodurch die Möglichkeit einer experimentellen Variabilität erheblich reduziert wird, da alle Stämme genau den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind. Während diese Technik in Salmonella enterica serovar Typhimurium entwickelt wurde, ist sie hochgradig anpassungsfähig an jeden genetisch verformbaren Organismus und nahezu jedes experimentelle Design, bei dem genaue Bakterienzahlen erforderlich sind, was eine neue Werkzeug zur Erhöhung der Genauigkeit und des Durchsatzes in mikrobiologischen Laboratorien ohne die Einschränkungen, die durch frühere Methoden auferlegt wurden.