مؤشر تنافسي رقمي قائم على PCR لتحليل عالي الإنتاجية للياقة البدنية في السالمونيلا
Summary
هذا النهج القائم على الجزيئية لتحديد اللياقة البدنية البكتيرية يسهل الكشف الدقيق والدقيق للكائنات الحية الدقيقة باستخدام الباركود الحمض النووي الجينومي فريدة من نوعها التي يتم قياسها كميا عن طريق PCR الرقمية. يصف البروتوكول حساب المؤشر التنافسي لسلالات السالمونيلا; ومع ذلك، فإن التكنولوجيا قابلة للتكيف بسهولة مع البروتوكولات التي تتطلب التحديد الكمي المطلق لأي كائن حي قابل للتطيل وراثياً.
Abstract
مؤشر تنافسي هو وسيلة شائعة تستخدم لتقييم اللياقة البدنية البكتيرية و / أو ضراوة. وتتجلى فائدة هذا النهج في سهولة أدائه وقدرته على توحيد اللياقة البدنية للعديد من السلالات لكائن حي من النوع البري. غير أن هذه التقنية محدودة بعلامات الفينوتيبيك المتاحة وعدد السلالات التي يمكن تقييمها في وقت واحد، مما يخلق الحاجة إلى عدد كبير من التجارب المكررة. بالتزامن مع أعداد كبيرة من التجارب، فإن تكاليف العمالة والمواد لتحديد كمية البكتيريا على أساس علامات الفينوتيبيك ليست ضئيلة. للتغلب على هذه الجوانب السلبية مع الاحتفاظ بالجوانب الإيجابية، قمنا بتطوير نهج قائم على الجزيئية لتحديد الكائنات الحية الدقيقة بشكل مباشر بعد هندسة العلامات الوراثية على الكروموسومات البكتيرية. فريدة من نوعها، تم إدراج 25 الباركود الحمض النووي زوج قاعدة في موضع حميدة على كروموسوم من نوع البرية وسلالات متحولة من السالمونيلا. وأجريت تجارب المنافسة في المختبر باستخدام الأولوكولا التي تتكون من سلالات مجمعة. وفي أعقاب المنافسة، تم تحديد الأرقام المطلقة لكل سلالة كمياً باستخدام الـ PCR الرقمي، وتم حساب المؤشرات التنافسية لكل سلالة من تلك القيم. تشير بياناتنا إلى أن هذا النهج لتحديد كمية السالمونيلا حساس للغاية، ودقيق، ودقيق للكشف عن كل من الكائنات الحية الدقيقة الوفيرة للغاية (اللياقة البدنية العالية) والنادرة (منخفضة اللياقة البدنية). بالإضافة إلى ذلك، هذه التقنية قابلة للتكيف بسهولة مع أي كائن حي تقريبا مع كروموسومات قادرة على التعديل، وكذلك لمختلف التصاميم التجريبية التي تتطلب التحديد الكمي المطلق للكائنات الحية الدقيقة.
Introduction
تقييم اللياقة البدنية وضراوة الكائنات المسببة للأمراض هو جانب أساسي من أبحاث علم الأحياء الدقيقة. وهو يمكّن من إجراء مقارنات بين السلالات أو بين الكائنات الحية المتحولة، مما يسمح للباحثين بتحديد أهمية بعض الجينات في ظل ظروف محددة. تقليديا، يستخدم تقييم virulence نموذج حيواني للعدوى باستخدام سلالات بكتيرية مختلفة ومراقبة نتائج الحيوان المصاب (على سبيل المثال الجرعة المعدية50، الجرعة المميتة50، وقت الوفاة ، شدة الأعراض ، عدم وجود الأعراض، وما إلى ذلك). ويقدم هذا الإجراء وصفا قيما للضراوة، ولكنه يتطلب سلالات لإحداث اختلافات كبيرة في النتائج من أجل الكشف عن الاختلافات من النوع البري. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج شبه كمية لأنه في حين يمكن قياس تطور المرض وشدة الأعراض كمياً ذاتياً مع مرور الوقت، فإن تفسير الشراسة مقارنة بالنوع البري هو أكثر نوعية (أي أكثر أو أقل أو بنفس القدر من القسوة). بديل شائع لإجراء اختبار العدوى الحيوانية هو توليد مؤشرات تنافسية (CIs)، وهي قيم تقارن مباشرة اللياقة البدنية أو ضراوة الإجهاد مع نظير من النوع البري في عدوى مختلطة1. ولهذه التقنية مزايا عديدة على النموذج الحيواني التقليدي للعدوى عن طريق توحيد التضوئ إلى سلالة من النوع البري وتحديد قيمة قابلة للقياس الكمي لتعكس درجة التوهين. ويمكن أيضا تكييف هذه التقنية لتحليل التفاعلات الجينية في البكتيريا عن طريق تحديد مؤشر تنافسي ملغى (COI)2. يسمح حساب COI لمجموعة من الكائنات الحية المتحولة للباحثين بتحديد ما إذا كان اثنان من الجينات يساهمان بشكل مستقل في مسببات الأمراض أو ما إذا كانا يشاركان في نفس مسار الشراسة ويعتمدان على بعضهما البعض. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب حساب CI تعداد البكتيريا التي يمكن أن توفر رؤى قيمة في مسببات الأمراض من الكائنات الحية. كما تسمح CIs وCOIs للباحثين لتقييم سلالات avirulent التي لا تسبب المرض السريري ولكن لا تزال لديها اختلافات في اللياقة البدنية. وهذه التقنية محدودة باستخدام علامات مقاومة المضادات الحيوية التقليدية لتحديد السلالات، وبالتالي الحد من عدد سلالات المدخلات إلى واحد أو اثنين فقط في كل مرة. وبسبب هذا القيد، هناك حاجة إلى أعداد كبيرة من المجموعات التجريبية والتكرارات، التي بالإضافة إلى زيادة تكاليف العمالة والمواد، تزيد أيضا من فرص التباين في الظروف التجريبية والنتائج غير الدقيقة. (للاطلاع على مراجعة شاملة لفوائد وتطبيقات استخدام العدوى المختلطة لدراسة التفاعلات بين الشخصيات واللياقة البدنية والجينات، انظر C.R. Beuzón وD.W. Holden 1)
وقد بذلت محاولات للتغلب على هذا القيد، مثل استخدام الخلايا ذات العلامات الفلورية كميا عن طريق قياس التدفق إلى الخلايا3و4و5. هذه التقنية كميا الخلايا باستخدام إما 1) وصفت الأجسام المضادة لعلامات phenotypic أو 2) أنتجت الذاتية البروتينات الفلورية. استخدام الأجسام المضادة المسماة لديه حد للكشف عن 1000 خلية / مل، وبالتالي يتطلب عدد كبير من الخلايا لتحليل3. الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية لديها علم وظائف الأعضاء المتغيرة وعرضة لتغيرات اللياقة البدنية الناجمة عن التعبير البروتين العالي6. كلا الأسلوبين محدودة بعدد علامات الفلورسنت التي يمكن اكتشافها باستخدام قياس التدفق. وقد تحقق تقدم في القياس الكمي الجزيئي من خلال تطوير تقنية الميكرور التي اكتشفت التوهين في 120 سلالات من عدوى مختلطة أولية من أكثر من 1000 سلالات في نموذج مورين7. وقد استخدمت هذه التقنية تحليلاً للRNA من سلالات متحولة، مما يؤدي إلى تباين كبير في النتيجة. ومع ذلك، فقد أثبتت أن مجموعات كبيرة من الإصابات المختلطة يمكن أن تكون أداة مفيدة وأنه باستخدام تقنيات الكشف الحساسة، يمكن تحديد الاختلافات في ضراوة البكتيريا. مع تطور تسلسل الجيل القادم، وسعت Tn-seq فائدة الطفرات transposon، مما يتيح طريقة قوية لتحديد كمية البكتيريا التي تم تغييرها عشوائيا8،9،10، 11. تم مؤخرا وضع بروتوكول بديل يلغي الحاجة إلى transposons وبدلا من ذلك يستخدم الباركود الحمض النووي لتحديد وتتبع التغيرات الجينية ومسارها بسهولة أكبر وتأثيرها على اللياقة البدنية12. هذه التكنولوجيا هي تقدم كبير، ولكن إدراج الباركود الجينوم لا يزال عملية عشوائية. للتغلب على العشوائية من التجارب السابقة، يون وآخرون وضعت طريقة لحساب CIs من سلالات السالمونيلا باستخدام الباركود الحمض النووي فريدة من نوعها إدراجها في مواقع دقيقة على كروموسومات البكتيريا13. تم الكشف عن سلالات الباركود فريدة من نوعها باستخدام طريقة المستندة إلى qPCR مع الأخضر SYBR والتمهيديات محددة لكل الباركود فريدة من نوعها. وكانت هذه التقنية محدودة بسبب القيود التي تفرضها شركة qPCR، بما في ذلك الاختلافات في كفاءة التمهيدي والحساسية المنخفضة، مما يدل على الحاجة إلى PCR المتداخلة قبل qPCR. ومع ذلك، أظهر هذا النهج أنه يمكن استغلال التعديلات الجينية المستهدفة للكشف عن برك السلالات البكتيرية المتعددة وإمكانية تحديدها كمياً.
في البروتوكول التالي، نقوم بوصف منهجية جديدة لإجراء تجارب المنافسة البكتيرية مع مجموعات كبيرة من الأولوكولا المختلطة تليها كمية دقيقة باستخدام تقنية PCR رقمية حساسة للغاية. ويشمل البروتوكول سلالات بكتيرية تحمل علامات وراثية مع شريط يُدرج على شريط يُدخل من نوع DNA الباركود الفريد على منطقة غير مؤذية من الكروموسوم. يسمح هذا التعديل للسلالات أن تكون كمية بسرعة ودقة باستخدام التكنولوجيا الجزيئية الحديثة بدلاً من التخفيفات التسلسلية التقليدية، والطلاء النسخة المتماثلة، وحساب وحدات تشكيل المستعمرة التي تعتمد على علامات phenotypic (أي مقاومة المضادات الحيوية ). وتسمح التعديلات بإجراء تقييم متزامن للعديد من السلالات في تلقيح واحد مجمع، مما يقلل إلى حد كبير من إمكانية التغير التجريبي لأن جميع السلالات تتعرض لنفس الظروف بالضبط. وعلاوة على ذلك، في حين تم تطوير هذه التقنية في السالمونيلا enterica سيروفار Typhimurium، فإنه قابل للتكيف للغاية مع أي كائن حي طيع وراثيا وتقريبا أي تصميم تجريبي حيث يلزم عدد البكتيريا دقيقة، وتوفير جديد أداة لزيادة الدقة والإنتاجية في مختبرات علم الأحياء الدقيقة دون القيود التي تفرضها الأساليب السابقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
القدرة على تحديد بدقة الكائنات الحية الدقيقة هي ذات أهمية قصوى لبحوث علم الأحياء الدقيقة، والقدرة على تعداد سلالات فريدة من نوعها من السكان مختلطة الأولية ثبت أن تكون أداة لا تقدر بثمن لتقييم اللياقة البدنية والصفات الشرسة في البكتيريا. ومع ذلك، فإن تقنيات تحقيق ذلك لم تتقدم في وتيرة الت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم البحوث التي وردت في هذا المنشور من قبل جورج ف. هاديكس رئيس صندوق بحوث الكلية والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) تحت رقم الجائزة GM103427. والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
