Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

Оценка пригодности и вирулентности патогенных организмов является фундаментальным аспектом микробиологических исследований. Это позволяет проводить сравнения между штаммами или между мутировавшими организмами, что позволяет исследователям определить важность определенных генов в определенных условиях. Традиционно, вирулентность оценка использует животных модель инфекции с использованием различных бактериальных штаммов и наблюдения за результатом инфицированного животного (например, инфекционная доза₅₀, Смертельная доза₅₀, время до смерти, тяжесть симптомов, отсутствие симптомы и т.д.). Эта процедура содержит ценные описания вирулентности, но она требует штаммов, чтобы вызвать значительные различия в результатах, с тем чтобы обнаружить отклонения от дикого типа. Кроме того, результаты являются полуколичественными, поскольку в то время как прогрессирование заболевания и тяжесть симптомов могут быть субъективно количественно с течением времени, интерпретация вирулентности по сравнению с диким типом является более качественной (т.е. больше, меньше или в равной степени вирулентным). Общей альтернативой для выполнения анализов инфекционной инфекции животных является создание конкурентоспособных индексов (CIs), значения, которые непосредственно сравнить фитнес или вирулентность штамма с диким типом аналога в смешанной инфекции¹. Этот метод имеет многочисленные преимущества перед традиционной животной моделью инфекции путем стандартизации вирулентности к штамму дикого типа и определения количественной оценки, отражающей степень ослабления. Этот метод также может быть адаптирован для анализа взаимодействия генов в бактериях, определив отмененный конкурентный индекс (COI)². Расчет COI для группы мутировавших организмов позволяет исследователям определить, независимо ли два гена способствуют патогенезу или если они участвуют в том же пути вирулентности и зависят друг от друга. Кроме того, расчет CI требует перечисления бактерий, которые могут обеспечить ценную информацию о патогенезе организмов. CIs и COIs также позволяют исследователям осла avirulent напряжения которые не причиняют клинические заболевания но все еще имеют разницы в пригодности. Этот метод ограничен использованием традиционных маркеров устойчивости к антибиотикам для выявления штаммов, тем самым ограничивая количество входных штаммов только одним или двумя за один раз. Из-за этого ограничения требуется большое количество экспериментальных групп и репликаций, что в дополнение к увеличению затрат на рабочую силу и материальные затраты, а также увеличивает возможности для изменчивости в экспериментальных условиях и неточных результатов. (Для тщательного анализа преимуществ и применений использования смешанных инфекций для изучения вирулентности, фитнеса и взаимодействия генов см. C.R. Beuzon и D.W. Holden ¹)

Были предприняты попытки преодолеть это ограничение, такие как использование флуоресцентно помеченных клеток количественно через поток цитометрии^3,4,5. Этот метод количественно клеток, использующих либо 1) помеченные антитела к фенотипическим маркерам или 2) эндогенно производства флуоресцентных белков. Использование помеченных антител имеет предел обнаружения 1000 клеток / мл, и поэтому требует большого количества клеток для анализа³. Клетки, выражающие флуоресцентные белки, имеют измененную физиологию ивосприимчивы к изменениям в фитнесе в результате высокой экспрессии белка 6. Оба метода ограничены количеством флуоресцентных маркеров, обнаруживаемых с помощью цитометрии потока. Прогресс в молекулярной количественной была достигнута за счет разработки метода microarray, которые обнаружили затусание в 120 штаммов от первоначальной смешанной инфекции более 1000 штаммов в модели мурин⁷. Этот метод использовал микроаррейный анализ РНК от мутировавших штаммов, которые приводят к значительной изменчивости в результате.  Тем не менее она установила, что большие пулы смешанных инфекций могут быть полезным инструментом и что, используя чувствительные методы обнаружения, можно выявить различия в бактериальной вирулентности. С развитием последовательности следующего поколения, Tn-seq расширил полезность транспозонных мутаций, что позволило мощный метод для количественной оценки бактерий, которые были случайно мутировали^{8,9,10, 11}. Альтернативный протокол был недавно разработан, что устраняет необходимость транспозонов и вместо этого использует ДНК штрих-коды для более легко гораздо выявления и отслеживания геномных изменений и их влияние на фитнес¹². Эта технология является важным прогрессом, но вставка геномных штрих-кодов по-прежнему является случайным процессом. Чтобы преодолеть случайность предыдущих экспериментов, Yoon et al. разработали метод расчета CIs штаммов сальмонеллы с помощью уникальных штрих-кодов ДНК, вставленных в точных местах на хромосомых бактерий¹³. Уникальные штрих-кодированные штаммы были обнаружены с помощью метода на основе qPCR с зеленым цветом SYBR и грунтовками, специфичными для каждого уникального штрих-кода. Этот метод был ограничен ограничениями, налагаемыми qPCR, включая различия в эффективности праймера и низкую чувствительность, о чем свидетельствует необходимость вложенного ПЦР до qPCR. Тем не менее этот подход продемонстрировал, что целевые геномные изменения могут быть использованы для обнаружения и потенциально количественной оценки пулов многочисленных бактериальных штаммов.

В следующем протоколе мы описываем новую методологию для проведения экспериментов бактериальной конкуренции с большими пулами смешанных инокула, а затем точной количественной оценки с использованием высокочувствительной цифровой техники ПЦР. Протокол включает в себя генетически маркировки бактериальных штаммов с уникальным штрих-кодом ДНК вставляется на безобидной области хромосомы. Эта модификация позволяет быстро и точно количественно производить штаммы с использованием современных молекулярных технологий вместо традиционных серийных разбавлений, реплики покрытия и подсчета колоний, образующих единицы, которые полагаются на фенотипические маркеры (т.е. устойчивость к антибиотикам (т.е. устойчивость к антибиотикам ). Изменения позволяют одновременно оценивать многие штаммы в одном объединенном инокулуме, существенно уменьшая возможность экспериментальной изменчивости, поскольку все штаммы подвергаются точно таким же условиям. Кроме того, в то время как этот метод был разработан в Salmonella enterica serovar Typhimurium, он очень адаптируется к любой генетически податливый организм и почти любой экспериментальный дизайн, где точные бактериальные подсчеты необходимы, обеспечивая новый инструмент для повышения точности и пропускной их пропускной связи в микробиологических лабораториях без ограничений, налагаемых предыдущими методами.