Digitale PCR-gebaseerde competitieve index voor high-throughput analyse van de geschiktheid in salmonella

Het beoordelen van de geschiktheid en virulentie van pathogene organismen is een fundamenteel aspect van microbiologie onderzoek. Hiermee kunnen vergelijkingen worden gemaakt tussen stammen of tussen gemuleerde organismen, waardoor onderzoekers het belang van bepaalde genen onder specifieke omstandigheden kunnen bepalen. Traditioneel gebruikt virulentie beoordeling een dierlijk model van infectie met verschillende bacteriële stammen en het observeren van de uitkomst van het besmette dier (bijv. infectieuze dosis₅₀, letale dosis₅₀, tijd tot overlijden, ernst van het symptoom, gebrek aan symptomen, enz.). Deze procedure biedt waardevolle beschrijvingen van virulentie, maar het vereist stammen om aanzienlijke verschillen in uitkomsten te veroorzaken om variaties van wild type te detecteren. Bovendien zijn de resultaten semi-kwantitatief, omdat, terwijl ziekteprogressie en symptoom ernst in de loop van de tijd subjectief kunnen worden gekwantificeerd, de interpretatie van virulentie vergeleken met wild-type meer kwalitatief is (d.w.z. meer, minder of even virulent). Een gemeenschappelijk alternatief voor het uitvoeren van dierlijke infectiviteit assays is het genereren van concurrerende indices (CIs), waarden die direct vergelijken fitness of virulentie van een stam aan een wild-type tegenhanger in een gemengde infectie¹. Deze techniek heeft tal van voordelen ten opzichte van een traditioneel diermodel van infectie door de virulentie te standaardiseren tot een wild type stam en het bepalen van een kwantificeerbare waarde om de mate van verzwakking weer te geven. Deze techniek kan ook worden aangepast om geninteracties in bacteriën te analyseren door het bepalen van een geannuleerde concurrerende index (COI)². Het berekenen van een COI voor een groep gemuleerde organismen stelt onderzoekers in staat te bepalen of twee genen zelfstandig bijdragen aan pathogenese of als ze betrokken zijn bij dezelfde virulentie route en afhankelijk van elkaar. Bovendien vereist het berekenen van een CI inventarisatie van bacteriën die waardevolle inzichten kunnen geven in de pathogenese van organismen. CIs en COIs stellen onderzoekers ook in staat om Avirulente stammen te onderzoeken die geen klinische ziekte veroorzaken, maar nog steeds verschillen in geschiktheid. Deze techniek wordt beperkt door het gebruik van traditionele antibioticaresistentie markers om stammen te identificeren, waardoor het aantal ingangs stammen beperken tot slechts één of twee tegelijk. Vanwege deze beperking zijn grote aantallen experimentele groepen en replicaten vereist, die naast het toevoegen aan arbeids-en materiaalkosten ook de mogelijkheden voor variabiliteit in experimentele omstandigheden en onnauwkeurige resultaten vergroot. (Voor een grondige beoordeling van de voordelen en toepassingen van het gebruik van gemengde infecties om virulentie, fitness en geninteracties te bestuderen, zie C.R. Beuzón en D.W. Holden ¹)

Er zijn pogingen ondernomen om deze beperking te overwinnen, zoals het gebruik van fluorescently gelabelde cellen gekwantificeerd via flow flowcytometrieonderzoeken^3,4,5. Deze techniek kwantificeert cellen met behulp van ofwel 1) gelabelde antilichamen tegen fenotypische markers of 2) endogeen geproduceerde fluorescerende eiwitten. Het gebruik van gelabelde antilichamen heeft een aantoonbaarheidsgrens van 1.000 cellen/mL en vereist daarom een groot aantal cellen om³te analyseren. Cellen die fluorescerende eiwitten uitdrukken hebben een veranderde fysiologie en zijn vatbaar voor fitness veranderingen als gevolg van hoge eiwit expressie⁶. Beide methoden worden beperkt door het aantal fluorescerende markers detecteerbaar met behulp van flow cytometrie. Een vooruitgang in moleculaire kwantificatie werd bereikt door de ontwikkeling van een microarray-techniek die verzwakking ontdekte in 120 stammen van een initiële gemengde infectie van meer dan 1.000 stammen in een Murine model⁷. Deze techniek gebruikt een microarray analyse van RNA van gemuleerde stammen, wat leidde tot een aanzienlijke variabiliteit in de uitkomst.  Niettemin stelde het dat grote groepen van gemengde infecties een nuttig hulpmiddel kunnen zijn en dat met behulp van gevoelige detectietechnieken verschillen in bacteriële virulentie kunnen worden geïdentificeerd. Met de ontwikkeling van de volgende generatie sequencing, breidde TN-SEQ het nut van transposon mutaties uit, wat een krachtige methode mogelijk maakt voor het kwantificeren van bacteriën die willekeurig werden gemuleerd^{8,9,10, 11}. Onlangs is een alternatief protocol ontwikkeld dat de noodzaak van transposons elimineert en in plaats daarvan DNA-barcodes gebruikt om de genomische veranderingen en hun impact op fitness¹²gemakkelijker te identificeren en bij te houden. Deze technologie is een belangrijke vooruitgang, maar het inbrengen van de genomische barcodes is nog steeds een willekeurig proces. Om de willekeurigheid van eerdere experimenten te overwinnen, ontwikkelde Yoon et al. een methode om het CIs van salmonella stammen te berekenen met behulp van unieke DNA-barcodes die op precieze locaties op de chromosomen van bacteriën¹³zijn geplaatst. Unieke met stammen werden gedetecteerd met behulp van een qPCR-gebaseerde methode met sybr Green en primers specifiek voor elke unieke barcode. De techniek werd beperkt door de door qPCR opgelegde beperkingen, waaronder verschillen in primer-efficiëntie en lage gevoeligheid, wat blijkt uit de noodzaak van geneste PCR voorafgaand aan qPCR. Niettemin heeft deze benadering aangetoond dat gerichte genomische modificaties kunnen worden benut voor het opsporen en mogelijk kwantificeren van Pools van meerdere bacteriële stammen.

In het volgende protocol beschrijven we een nieuwe methodologie om bacteriële concurrentie experimenten uit te voeren met grote Pools van gemengde entmateriaal, gevolgd door nauwkeurige kwantificering met behulp van een zeer gevoelige digitale PCR-techniek. Het protocol omvat het genetisch labelen van bacteriële stammen met een unieke DNA-Barcode ingevoegd op een onschadelijke regio van het chromosoom. Deze modificatie maakt het mogelijk om stammen snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van moderne moleculaire technologie in plaats van traditionele seriële verdunningen, replica plating, en tellen kolonie vormende eenheden die afhankelijk zijn van fenotypische markers (d.w.z. antibioticaresistentie ). De wijzigingen maken gelijktijdige beoordeling van vele stammen in één gegroepeerd entmateriaal mogelijk, waardoor de mogelijkheid van experimentele variabiliteit aanzienlijk wordt verminderd, omdat alle stammen aan exact dezelfde voorwaarden worden blootgesteld. Bovendien, terwijl deze techniek werd ontwikkeld in salmonella heliobacter Serovar typhimurium, het is zeer aanpasbaar aan een genetisch smeedbaar organisme en bijna elk experimenteel ontwerp waar nauwkeurige bacteriële tellingen zijn vereist, het verstrekken van een nieuwe tool om de nauwkeurigheid en doorvoer in microbiologie laboratoria te verhogen zonder de beperkingen opgelegd door eerdere methoden.