Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

Valutare la forma fisica e la virulenza degli organismi patogeni è un aspetto fondamentale della ricerca microbiologica. Consente di confrontare tra ceppi o tra organismi mutati, il che consente ai ricercatori di determinare l’importanza di determinati geni in condizioni specifiche. Tradizionalmente, la valutazione della virulenza utilizza un modello animale di infezione utilizzando diversi ceppi batterici e osservando l’esito dell’animale infetto (ad esempio Contagiosa₅₀, Dose letale₅₀, tempo a morte, gravità dei sintomi, mancanza di sintomi, ecc.). Questa procedura fornisce preziose descrizioni della virulenza, ma richiede che i ceppi causino notevoli differenze nei risultati al fine di rilevare variazioni da wild-type. Inoltre, i risultati sono semi-quantitativi perché mentre la progressione della malattia e la gravità dei sintomi possono essere soggettivamente quantificate nel tempo, l’interpretazione della virulenza rispetto al tipo selvaggio è più qualitativa (cioè più, meno o ugualmente virulenzia). Un’alternativa comune ai saggi di infettività degli animali per animali di esecuzione consiste nel generare indici competitivi (CI), valori che confrontano direttamente la forma fisica o la virulenza di un ceppo con una controparte di tipo selvatico in un’infezione mista¹. Questa tecnica ha numerosi vantaggi rispetto a un modello animale tradizionale di infezione standardizzando la virulenza su un ceppo di tipo selvatico e determinando un valore quantificabile per riflettere il grado di attenuazione. Questa tecnica può anche essere adattata per analizzare le interazioni geniche nei batteri determinando un indice competitivo cancellato (COI)². Il calcolo di un COI per un gruppo di organismi mutati consente ai ricercatori di determinare se due geni contribuiscono in modo indipendente alla patogenesi o se sono coinvolti nella stessa via di virulenza e dipendono l’uno dall’altro. Inoltre, il calcolo di una CI richiede l’enumerazione di batteri che possono fornire preziose informazioni sulla patogenesi degli organismi. Cite e COI consentono inoltre ai ricercatori di valutare ceppi avirulenti che non causano malattie cliniche ma hanno ancora differenze di forma fisica. Questa tecnica è limitata dall’uso di marcatori di resistenza agli antibiotici tradizionali per identificare i ceppi, limitando così il numero di ceppi di ingresso a uno o due alla volta. A causa di questa limitazione, è necessario un gran numero di gruppi sperimentali e repliche, che oltre ad aumentare i costi di manodopera e materiali, aumenta anche le opportunità di variabilità in condizioni sperimentali e risultati imprecisi. (Per un esame approfondito dei benefici e delle applicazioni dell’uso di infezioni miste per studiare la virulenza, la forma fisica e le interazioni geniche, vedere C.R. Beuzàn e D.W. Holden ¹)

Si è cercato di superare questa limitazione, come l’uso di cellule fluorescenti quantificate tramite citometria di flusso^3,4,5. Questa tecnica quantifica le cellule utilizzando 1) etichettate anticorpi contro i marcatori fenotipici o 2) prodotte endogenamente proteine fluorescenti. L’uso di anticorpi etichettati ha un limite di rilevamento di 1.000 cellule /mL, e quindi richiede un numero elevato di cellule per analizzare³. Le cellule che esprimono proteine fluorescenti hanno una fisiologia alterata e sono suscettibili ai cambiamenti di fitness derivanti dall’espressione ad alte proteine⁶. Entrambi i metodi sono limitati dal numero di marcatori fluorescenti rilevabili utilizzando la citometria di flusso. Un progresso nella quantificazione molecolare è stato raggiunto attraverso lo sviluppo di una tecnica di microarray che ha rilevato l’attenuazione in 120 ceppi da un’infezione mista iniziale di oltre 1.000 ceppi in un modello murino⁷. Questa tecnica ha utilizzato un’analisi microarray dell’RNA da ceppi mutati, che portano a una notevole variabilità nel risultato.  Tuttavia, ha stabilito che grandi pool di infezioni miste possono essere uno strumento utile e che utilizzando tecniche di rilevamento sensibili, possono essere identificate differenze nella virulenza batterica. Con lo sviluppo del sequenziamento di nuova generazione, Tn-seq ha ampliato l’utilità delle mutazioni trasposoni, consentendo un potente metodo per quantificare i batteri che sono stati mutati casualmente^{8,9,10, 11}. Recentemente è stato sviluppato un protocollo alternativo che elimina la necessità di trasposoni e utilizza invece i codici a barre del DNA per identificare e monitorare più facilmente i cambiamenti genomici e il loro impatto sulla forma fisica¹². Questa tecnologia è un importante progresso, ma l’inserimento dei codici a barre genomici è ancora un processo casuale. Per superare la casualità degli esperimenti precedenti, Yoon e altri hanno sviluppato un metodo per calcolare i ceppi di Codi di Salmonella utilizzando codici a barre specifici del DNA inseriti in posizioni precise sui cromosomi dei batteri¹³. Sono stati rilevati ceppi in codice a barre unici utilizzando un metodo basato su qPCR con verde SYBR e primer specifici per ogni codice a barre univoco. La tecnica era limitata da vincoli imposti da qPCR, comprese le differenze nell’efficienza dei primer e dalla bassa sensibilità, evidenziate dalla necessità di pcR nidificati prima di qPCR. Tuttavia, questo approccio ha dimostrato che le modifiche genomiche mirate potrebbero essere sfruttate per rilevare e potenzialmente quantificare pool di ceppi batterici multipli.

Nel seguente protocollo, descriviamo una nuova metodologia per eseguire esperimenti di competizione batterica con grandi pool di inocua misti seguiti da una quantificazione accurata utilizzando una tecnica PCR digitale altamente sensibile. Il protocollo prevede ceppi batterici geneticamente etichettanti con un codice a barre DNA unico inserito su una regione innocua del cromosoma. Questa modifica consente di quantificare rapidamente e con precisione i ceppi utilizzando la moderna tecnologia molecolare invece delle tradizionali diluizioni seriali, la placcatura delle repliche e il conteggio delle unità formanti della colonia che si basano su marcatori fenotipici (cioè la resistenza agli antibiotici ). Le modifiche consentono la valutazione simultanea di molti ceppi in un unico inoculo raggruppato, riducendo sostanzialmente la possibilità di variabilità sperimentale perché tutti i ceppi sono esposti alle stesse condizioni esatte. Inoltre, mentre questa tecnica è stata sviluppata in Salmonella enterica sierovar Typhimurium, è altamente adattabile a qualsiasi organismo geneticamente malleabile e quasi qualsiasi progetto sperimentale in cui sono necessari conteggi batterici accurati, fornendo un nuovo strumento per aumentare la precisione e la produttività nei laboratori di microbiologia senza i vincoli imposti dai metodi precedenti.