דיגיטלי PCR מבוססי אינדקס תחרותי עבור ניתוח תפוקה גבוהה של כושר בסלמונלה

הערכת כושר והתקפה של אורגניזמים פתוגניים הוא היבט בסיסי של מחקר המיקרוביולוגיה. היא מאפשרת השוואות להתבצע בין זנים או בין אורגניזמים מוטציה, אשר מאפשר לחוקרים לקבוע את החשיבות של גנים מסוימים בתנאים ספציפיים. באופן מסורתי, הערכה אלימה משתמשת במודל החי של זיהום באמצעות זנים חיידקיים שונים והתבוננות בתוצאה של החיה הנגועה (למשל מינון זיהומיות₅₀, מינון קטלני₅₀, זמן למוות, חומרת הסימפטום, חוסר סימפטומים וכו ‘). הליך זה מספק תיאורים יקרי ערך של התקפה אלימה, אבל זה דורש זנים כדי לגרום הבדלים ניכרים בתוצאות כדי לזהות וריאציות מסוג פראי. יתר על כן, התוצאות הן חצי כמותית, כי בעוד התקדמות המחלה ואת חומרת הסימפטום יכול להיות סובייקטיבי לאורך זמן, פרשנות של התקפה אלימה בהשוואה לסוג פראי הוא האיכותי יותר (כלומר, יותר, פחות, או המוני באותה מידה). חלופה מקובלת לביצוע בעלי חיים הנגועים הוא ליצור מדדים תחרותיים (CIs), ערכים השווים ישירות כושר או התקפה אלימה של זן לעמיתו מסוג פראי בזיהום מעורב¹. לטכניקה זו יש יתרונות רבים לעומת מודל בעלי חיים מסורתי של זיהום באמצעות סטנדרטיזציה של התקפה אלימה למתח מסוג פראי וקביעת ערך כולל כדי לשקף את מידת ההנחתה. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאמת לניתוח אינטראקציות גנים בחיידקים על ידי קביעת אינדקס תחרותי בוטלה (COI)². חישוב COI עבור קבוצה של אורגניזמים מוטציה מאפשר לחוקרים לקבוע אם שני גנים באופן עצמאי לתרום פתוגנזה או אם הם מעורבים מסלול התקפה אלימה ותלויים זה בזה. בנוסף, חישוב CI דורש ספירה של חיידקים אשר יכולים לספק תובנות יקרות לתוך הפתוגנזה של אורגניזמים. CIs ו COIs גם לאפשר לחוקרים הישבנים avirulent זנים שאינם גורמים למחלות קליניות אבל עדיין יש הבדלים בכושר. טכניקה זו מוגבלת על ידי שימוש של סמנים מסורתיים עמידות לאנטיביוטיקה כדי לזהות זנים, ובכך להגביל את מספר זני קלט רק אחד או שניים בכל פעם. בשל מגבלה זו, נדרשים מספר רב של קבוצות ומשכפל ניסויים, שבנוסף להוספת העבודה ועלויות החומר, מגביר גם הזדמנויות לשונות בתנאים ניסיוניים ותוצאות לא מדויקות. (לסקירה יסודית של היתרונות והיישומים של שימוש בזיהומים מעורבים לחקר התקפה אלימה, כושר ואינטראקציות גנים, ראה C.R. Beuzón ו D.W. הולדן ¹)

ניסיונות נעשו כדי להתגבר על מגבלה זו, כגון שימוש בתאים fluorescently המסומנים באופן כימות דרך זרם cy,^3,4,5. טכניקה זו מכמת את התאים באחד משני הצדדים המסומנים בנוגדנים לסמנים או 2) המיוצרים באופן שורש חלבונים פלורסצאריים. לשימוש בנוגדנים עם תוויות יש מגבלה של גילוי של 1,000 תאים/mL, ולכן דורש מספר גבוה של תאים כדי לנתח³. תאים המבטאים חלבונים פלורסנט יש פיזיולוגיה שונה והם רגישים לשינויי כושר וכתוצאה מביטוי חלבון גבוה⁶. שתי השיטות מוגבלות על ידי מספר סמני פלורסנט הנמצא באמצעות הזרימה cy, try. התקדמות בקוונפיקציה מולקולרית הושגה באמצעות פיתוח של טכניקה microarray שזיהה החליש ב 120 זנים מזיהום ראשוני מעורב של מעל 1,000 זנים במודל murine⁷. טכניקה זו מנוצל ניתוח microarray של RNA מ זנים מוטציה, אשר להוביל לשונות ניכרת בתוצאה.  אף על פי כן, היא הקימה כי בריכות גדולות של זיהומים מעורבים יכול להיות כלי שימושי, כי על ידי ניצול טכניקות זיהוי רגיש, הבדלים התקפה אלימה חיידקים ניתן לזהות. עם פיתוח של רצף הדור הבא, Tn-seq הרחיב את כלי השירות של טרנספסון מוטציות, המאפשר שיטה רבת עוצמה עבור חיידקים שהיו מוטציה באקראי^8,9,10, . בסדר, ¹¹ פרוטוקול חלופי פותחה לאחרונה כי מבטלת את הצורך בטרנספסונים ובמקום זאת משתמשת ברקודים DNA כדי לזהות בקלות רבה יותר ולעקוב אחר שינויים גנומית ואת השפעתם על כושר¹². טכנולוגיה זו היא התקדמות גדולה, אבל החדרת ברקודים גנומית הוא עדיין תהליך אקראי. כדי להתגבר על אקראיות של ניסויים קודמים, יון ואח ‘ פיתחה שיטה כדי לחשב את החבר של העמים סלמונלה זנים באמצעות ברקודים DNA ייחודי מוכנס במיקומים מדויקים על הכרומוזומים של חיידקים¹³. זנים ברקודים ייחודיים זוהו באמצעות שיטה מבוססת qPCR עם SYBR ירוק ומיוחד התחל כל ברקוד ייחודי. הטכניקה הוגבלה על-ידי אילוצים שהוטלו על-ידי qPCR, כולל הבדלים ביעילות תחל ורגישות נמוכה, המעידים על הצורך בקינון-PCR לפני qPCR. אף על פי כן, גישה זו הוכיחה כי שינויים ממוקדות גנומית יכול להיות מנוצלת לאיתור ופוטנציאל לכמת בריכות של זנים חיידקיים מרובים.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים מתודולוגיה הרומן לבצע ניסויים בתחרות חיידקים עם בריכות גדולות של מעורבות מעורב ואחריו כימות מדויקת באמצעות טכניקה דיגיטלית רגישה מאוד. הפרוטוקול כרוך גנטית-תיוג זנים חיידקיים עם ברקוד DNA ייחודי מוכנס על אזור לא מזיק של הכרומוזום. שינוי זה מאפשר לזנים להיות במהירות ובאופן מדויק בקוונט באמצעות טכנולוגיה מולקולרית מודרנית במקום מדלל סדרתי מסורתי, ציפוי משוכפל, ו ספירה המושבה היוצרים יחידות המסתמכים על סמנים פנוטימית (כלומר עמידות לאנטיביוטיקה ). השינויים מאפשרים הערכה בו של זנים רבים במאגר יחיד, הפחתת באופן משמעותי את האפשרות של השתנות ניסיוני כי כל הזנים חשופים לאותם תנאים בדיוק. יתר על כן, בעוד טכניקה זו פותחה ב סלמונלה enterica Serovmuריום, זה מאוד להתאמה לכל אורגניזם מחושל גנטית כמעט כל עיצוב ניסיוני שבו ספירות חיידקים מדויקים נדרשים, מתן חדש כדי להגדיל את הדיוק והתפוקה במעבדות המיקרוביולוגיה ללא האילוצים המוטלים על-ידי שיטות קודמות.