Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

Evaluar la aptitud y la virulencia de los organismos patógenos es un aspecto fundamental de la investigación en microbiología. Permite realizar comparaciones entre cepas o entre organismos mutados, lo que permite a los investigadores determinar la importancia de ciertos genes en condiciones específicas. Tradicionalmente, la evaluación de la virulencia utiliza un modelo animal de infección utilizando diferentes cepas bacterianas y observando el resultado del animal infectado (por ejemplo, Dosis Infecciosa₅₀, Dosis letal_50,tiempo hasta la muerte, gravedad de los síntomas, falta de síntomas, etc.). Este procedimiento proporciona descripciones valiosas de la virulencia, pero requiere que las cepas causen diferencias considerables en los resultados para detectar variaciones de tipo salvaje. Además, los resultados son semicuantitativos porque mientras que la progresión de la enfermedad y la gravedad de los síntomas se pueden cuantificar subjetivamente con el tiempo, la interpretación de la virulencia en comparación con el tipo salvaje es más cualitativa (es decir, más, menos o igualmente virulenta). Una alternativa común a la realización de ensayos de infectividad animal es generar índices competitivos (CIs), valores que comparan directamente la aptitud o virulencia de una cepa con una contraparte de tipo salvaje en una infección mixta¹. Esta técnica tiene numerosas ventajas sobre un modelo animal tradicional de infección al estandarizar la virulencia a una cepa de tipo salvaje y determinar un valor cuantificable para reflejar el grado de atenuación. Esta técnica también se puede adaptar para analizar las interacciones genéticas en las bacterias mediante la determinación de un índice competitivo cancelado (COI)². El cálculo de un COI para un grupo de organismos mutados permite a los investigadores determinar si dos genes contribuyen de forma independiente a la patogénesis o si están implicados en la misma vía de virulencia y dependen entre sí. Además, el cálculo de un CI requiere la enumeración de bacterias que pueden proporcionar información valiosa sobre la patogénesis de los organismos. Los COI y los COI también permiten a los investigadores assimilar a cepas avirulentas que no causan enfermedades clínicas pero que todavía tienen diferencias en la aptitud física. Esta técnica está limitada por el uso de marcadores tradicionales de resistencia a antibióticos para identificar cepas, limitando así el número de cepas de entrada a sólo una o dos a la vez. Debido a esta limitación, se requiere un gran número de grupos experimentales y réplicas, que además de aumentar los costos de mano de obra y materiales, también aumenta las oportunidades de variabilidad en condiciones experimentales y resultados inexactos. (Para una revisión exhaustiva de los beneficios y aplicaciones del uso de infecciones mixtas para estudiar la virulencia, la aptitud y las interacciones genéticas, véase C.R. Beuzón y D.W. Holden ¹)

Se ha intentado superar esta limitación, como el uso de células etiquetadas fluorescentes cuantificadas a través de la citometría de flujo^3,4,5. Esta técnica cuantifica las células utilizando 1) anticuerpos etiquetados para marcadores fenotípicos o 2) proteínas fluorescentes producidas endógenamente. El uso de anticuerpos etiquetados tiene un límite de detección de 1.000 células/ml, y por lo tanto requiere un alto número de células para analizar³. Las células que expresan proteínas fluorescentes tienen una fisiología alterada y son susceptibles a cambios de aptitud resultantes de la alta expresión proteica⁶. Ambos métodos están limitados por el número de marcadores fluorescentes detectables mediante citometría de flujo. Se logró un avance en la cuantificación molecular mediante el desarrollo de una técnica de microarray que detectó la atenuación en 120 cepas a partir de una infección mixta inicial de más de 1.000 cepas en un modelo murino^7. Esta técnica utilizó un análisis de microarray de ARN a partir de cepas mutadas, lo que condujo a una considerable variabilidad en el resultado.  Sin embargo, estableció que grandes grupos de infecciones mixtas pueden ser una herramienta útil y que mediante la utilización de técnicas de detección sensibles, se pueden identificar diferencias en la virulencia bacteriana. Con el desarrollo de la secuenciación de próxima generación, Tn-seq amplió la utilidad de las mutaciones transposon, permitiendo un poderoso método para cuantificar bacterias que fueron mutadas aleatoriamente^{8,9,10, 11}. Recientemente se desarrolló un protocolo alternativo que elimina la necesidad de transposones y en su lugar utiliza códigos de barras de ADN para identificar y realizar un seguimiento más fácil de los cambios genómicos y su impacto en la aptitud^12. Esta tecnología es un avance importante, pero la inserción de los códigos de barras genómicos sigue siendo un proceso aleatorio. Para superar la aleatoriedad de experimentos anteriores, Yoon y otros desarrollaron un método para calcular los CI de las cepas de Salmonella utilizando códigos de barras de ADN únicos insertados en ubicaciones precisas en los cromosomas de la bacteria^13. Se detectaron cepas únicas de códigos de barras utilizando un método basado en qPCR con verde SYBR y imprimaciones específicas para cada código de barras único. La técnica se vio limitada por las restricciones impuestas por qPCR, incluidas las diferencias en la eficiencia de imprimación y la baja sensibilidad, evidenciadas por la necesidad de PCR anidado antes de qPCR. Sin embargo, este enfoque demostró que las modificaciones genómicas específicas podían ser explotadas para detectar y potencialmente cuantificar los grupos de múltiples cepas bacterianas.

En el siguiente protocolo, describimos una metodología novedosa para realizar experimentos de competencia bacteriana con grandes piscinas de inóculas mixtas seguidas de una cuantificación precisa utilizando una técnica de PCR digital altamente sensible. El protocolo implica cepas bacterianas de etiquetado genética con un código de barras de ADN único insertado en una región inocua del cromosoma. Esta modificación permite cuantificar las cepas de forma rápida y precisa utilizando tecnología molecular moderna en lugar de diluciones seriales tradicionales, replicación y conteo de unidades formadoras de colonias que se basan en marcadores fenotípicos (es decir, resistencia a los antibióticos ). Las modificaciones permiten la evaluación simultánea de muchas cepas en un solo inóculo agrupado, reduciendo sustancialmente la posibilidad de variabilidad experimental porque todas las cepas están expuestas a las mismas condiciones exactas. Además, si bien esta técnica fue desarrollada en Salmonella enterica serovar Typhimurium, es altamente adaptable a cualquier organismo genéticamente maleable y casi cualquier diseño experimental donde se requieran recuentos bacterianos precisos, proporcionando un nuevo para aumentar la precisión y el rendimiento en los laboratorios de microbiología sin las restricciones impuestas por métodos anteriores.