Índice competitivo baseado em PCR digital para análise de alta produtividade de aptidão em Salmonella

Avaliar a aptidão e a virulência de organismos patogénicos é um aspecto fundamental da pesquisa em microbiologia. Permite comparações entre cepas ou entre organismos mutantes, o que permite que os pesquisadores determinem a importância de determinados genes em condições específicas. Tradicionalmente, a avaliação de virulência utiliza um modelo animal de infecção usando diferentes cepas bacterianas e observando o resultado do animal infectado (por exemplo, dose infecciosa₅₀, dose letal₅₀, tempo até a morte, gravidade dos sintomas, falta de sintomas, etc.). Este procedimento fornece descrições valiosas da virulência, mas exige que as tensões causem diferenças consideráveis nos resultados a fim detectar variações do selvagem-tipo. Além disso, os resultados são semiquantitativos, pois enquanto a progressão da doença e a gravidade dos sintomas podem ser quantificadas subjetivamente ao longo do tempo, a interpretação da virulência comparada ao tipo selvagem é mais qualitativa (ou seja, mais, menos ou igualmente virulenta). Uma alternativa comum à realização de ensaios de infectividade animal é gerar índices competitivos (CIs), valores que comparam diretamente a aptidão ou a virulência de uma cepa a uma contraparte de tipo selvagem em uma infecção mista¹. Esta técnica tem inúmeras vantagens sobre um modelo animal tradicional de infecção, padronando a virulência para uma estirpe de tipo selvagem e determinando um valor quantificável para refletir o grau de atenuação. Esta técnica também pode ser adaptada para analisar as interações genéticas em bactérias, determinando um índice competitivo cancelado (COI)². O cálculo de um COI para um grupo de organismos mutados permite que os pesquisadores determinem se dois genes contribuem de forma independente para a patogênese ou se estão envolvidos na mesma via de virulência e dependem uns dos outros. Adicionalmente, calcular um CI exige a enumeração das bactérias que podem fornecer introspecções valiosas na patogénese dos organismos. CIs e COIs também permitem que os pesquisadores para jumentos avirulent cepas que não causam doença clínica, mas ainda têm diferenças na aptidão. Esta técnica é limitada pelo uso de marcadores tradicionais de resistência a antibióticos para identificar cepas, limitando assim o número de cepas de entrada para apenas um ou dois de cada vez. Devido a essa limitação, é necessário um grande número de grupos experimentais e repetições, o que, além de acrescentar aos custos trabalhistas e materiais, também aumenta as oportunidades de variabilidade em condições experimentais e resultados imprecisos. (Para uma revisão minuciosa dos benefícios e aplicações do uso de infecções mistas para estudar a virulência, a aptidão e as interações genéticas, ver C.R. Beuzón e DW Holden ¹)

As tentativas foram feitas para superar esta limitação, tal como o uso de pilhas fluorescently-etiquetadas quantificadas através da citometria de fluxo^3,4,5. Esta técnica quantifica as células usando 1) anticorpos rotulados para marcadores fenotípicos ou 2) proteínas fluorescentes produzidas endogenamente. O uso de anticorpos rotulados tem um limite de detecção de 1.000 células/mL e, portanto, requer um elevado número de células para analisar³. As células que expressam proteínas fluorescentes têm uma fisiologia alterada e são suscetíveis a alterações de aptidão resultantes da alta expressão protéica⁶. Ambos os métodos são limitados pelo número de marcadores fluorescentes detectável usando a citometria de fluxo. Um avanço na quantificação molecular foi conseguido com o desenvolvimento de uma técnica do microarray que detectaram a atenuação em 120 tensões de uma infecção misturada inicial sobre de 1.000 tensões em um modelo murino⁷. Esta técnica utilizou uma análise do microarray do RNA das tensões mutado, que conduzem à variabilidade considerável no resultado.  Não obstante, estabeleceu que as grandes associações de infecções misturadas podem ser uma ferramenta útil e que utilizando técnicas sensíveis da deteção, as diferenças na virulência bacteriana podem ser identificadas. Com o desenvolvimento do sequenciamento da próxima geração, TN-Seq expandiu a utilidade das mutações de transposon, possibilitando um método potente para quantificar as bactérias que foram aleatoriamente mutadas^8,9,10, o ¹¹. Um protocolo alternativo foi desenvolvido recentemente que elimina a necessidade para transposons e usa preferivelmente códigos de barras do ADN para identificar mais facilmente e controlar mudanças genomic e seu impacto na aptidão¹². Esta tecnologia é um avanço importante, mas a inserção dos códigos de barras genômicos ainda é um processo aleatório. Para superar a aleatoriedade de experimentos anteriores, Yoon et al. desenvolveram um método para calcular os CIs de cepas de Salmonella usando códigos de barras de DNA únicos inseridos em locais precisos sobre os cromossomas das bactérias¹³. Cepas com código de barras exclusivas foram detectadas usando um método baseado em qPCR com verde SYBR e primers específicos para cada código de barras exclusivo. A técnica foi limitada por restrições impostas pela qPCR, incluindo diferenças na eficiência da cartilha e baixa sensibilidade, evidenciadas pela necessidade de Nested-PCR antes da qPCR. Não obstante, esta aproximação demonstrou que as modificações genomic alvejadas poderiam ser exploradas para detectar e potencialmente quantificar associações de tensões bacterianas múltiplas.

No seguinte protocolo, nós descrevemos uma metodologia nova para executar experimentos bacterianos da competição com as grandes associações do inóculos misturado seguidas pela quantificação exata usando uma técnica digital altamente sensível do PCR. O protocolo envolve cepas bacterianas geneticamente rotuladoras com um código de barras de DNA único inserido em uma região inócuo do cromossomo. Esta modificação permite que as tensões sejam rapidamente e precisamente quantificadas usando a tecnologia molecular moderna em vez das diluições seriais tradicionais, do chapeamento da réplica, e da contagem de unidades formando da colônia que dependem dos marcadores fenotípicos (isto é resistência antibiótica ). As modificações permitem a avaliação simultânea de muitas cepas em um único inoculto agrupada, reduzindo substancialmente a possibilidade de variabilidade experimental, pois todas as cepas são expostas às mesmas condições exatas. Além disso, enquanto esta técnica foi desenvolvida em Salmonella enterica sorovar typhimurium, é altamente adaptável a qualquer organismo geneticamente maleável e quase qualquer experimento experimental onde são necessárias contagens bacterianas precisas, proporcionando uma nova ferramenta para aumentar a exatidão e a taxa de transferência em laboratórios da microbiologia sem as limitações impostas por métodos precedentes.