Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

L’évaluation de la condition physique et de la virulence des organismes pathogènes est un aspect fondamental de la recherche en microbiologie. Il permet de faire des comparaisons entre les souches ou entre les organismes mutés, ce qui permet aux chercheurs de déterminer l’importance de certains gènes dans des conditions spécifiques. Traditionnellement, l’évaluation de la virulence utilise un modèle animal d’infection à l’aide de différentes souches bactériennes et en observant les résultats de l’animal infecté (p. ex. Dose infectieuse₅₀, Dose létale₅₀, temps de mort, sévérité des symptômes, absence de symptômes, etc.). Cette procédure fournit des descriptions précieuses de la virulence, mais elle exige des souches de causer des différences considérables dans les résultats afin de détecter les variations de type sauvage. En outre, les résultats sont semi-quantitatifs parce que si la progression de la maladie et la gravité des symptômes peuvent être subjectivement quantifiées au fil du temps, l’interprétation de la virulence par rapport au type sauvage est plus qualitative (c.-à-d. plus, moins, ou tout aussi virulente). Une alternative commune aux essais d’infectiosité animale est de générer des indices concurrentiels (CI), des valeurs qui comparent directement la forme physique ou la virulence d’une souche à une contrepartie de type sauvage dans une infection mixte¹. Cette technique présente de nombreux avantages par rapport à un modèle animal traditionnel d’infection en standardisant la virulence d’une souche de type sauvage et en déterminant une valeur quantifiable pour refléter le degré d’atténuation. Cette technique peut également être adaptée pour analyser les interactions génétiques chez les bactéries en déterminant un indice concurrentiel annulé (COI)². Le calcul d’un ICO pour un groupe d’organismes mutés permet aux chercheurs de déterminer si deux gènes contribuent indépendamment à la pathogénie ou s’ils sont impliqués dans la même voie de virulence et dépendent les uns des autres. En outre, le calcul d’un CI nécessite l’énumération des bactéries qui peuvent fournir des informations précieuses sur la pathogénie des organismes. Les IC et les IC permettent également aux chercheurs d’asses souches avirulentes qui ne causent pas de maladie clinique, mais qui ont encore des différences de condition physique. Cette technique est limitée par l’utilisation de marqueurs traditionnels de résistance aux antibiotiques pour identifier les souches, limitant ainsi le nombre de souches d’entrée à seulement une ou deux à la fois. En raison de cette limitation, un grand nombre de groupes expérimentaux et de répliques sont nécessaires, ce qui, en plus d’augmenter les coûts de main-d’œuvre et de matériaux, augmente également les possibilités de variabilité dans les conditions expérimentales et les résultats inexacts. (Pour un examen approfondi des avantages et des applications de l’utilisation d’infections mixtes pour étudier la virulence, la condition physique et les interactions génétiques, voir C.R. Beuzon et D.W. Holden ¹)

Des tentatives ont été faites pour surmonter cette limitation, comme l’utilisation de cellules fluorescentes quantifiées par cytométrie de flux^3,4,5. Cette technique quantifie les cellules à l’aide d’anticorps étiquetés 1) à des marqueurs phénotypiques ou 2) de protéines fluorescentes produites endogènement. L’utilisation d’anticorps étiquetés a une limite de détection de 1000 cellules/mL, et nécessite donc un grand nombre de cellules pour analyser³. Les cellules exprimant des protéines fluorescentes ont une physiologie altérée et sont sensibles aux changements de forme physique résultant de l’expression riche en protéines⁶. Les deux méthodes sont limitées par le nombre de marqueurs fluorescents détectables à l’aide de la cytométrie du débit. Un progrès dans la quantification moléculaire a été réalisé par le développement d’une technique de microarray qui a détecté l’atténuation dans 120 souches d’une infection mélangée initiale de plus de 1.000 souches dans un modèle de murine⁷. Cette technique a utilisé une analyse de microarray de l’ARN des souches mutées, qui mènent à la variabilité considérable dans le résultat.  Néanmoins, il a établi que de grands bassins d’infections mixtes peuvent être un outil utile et qu’en utilisant des techniques de détection sensibles, des différences dans la virulence bactérienne peuvent être identifiées. Avec le développement du séquençage de la prochaine génération, Tn-seq a élargi l’utilité des mutations transposon, permettant une méthode puissante pour quantifier les bactéries qui ont été mutées au hasard^{8,9,10, 11}. Un protocole alternatif a été récemment développé qui élimine le besoin de transposons et utilise plutôt des codes-barres d’ADN pour identifier et suivre plus facilement les changements génomiques et leur impact sur la condition physique¹². Cette technologie est un progrès majeur, mais l’insertion des codes à barres génomiques est encore un processus aléatoire. Pour surmonter le caractère aléatoire des expériences précédentes, Yoon et coll. ont mis au point une méthode pour calculer les IC des souches de Salmonella à l’aide de codes-barres d’ADN uniques insérés à des endroits précis sur les chromosomes des bactéries¹³. Des souches à code à barres uniques ont été détectées à l’aide d’une méthode qPCR avec sYBR vert et amorces spécifiques à chaque code-barres unique. La technique a été limitée par des contraintes imposées par qPCR, y compris des différences dans l’efficacité des amorces et une faible sensibilité, comme en témoigne la nécessité de l’imminance-PCR avant qPCR. Néanmoins, cette approche a démontré que des modifications génomiques ciblées pouvaient être exploitées pour détecter et quantifier potentiellement des bassins de souches bactériennes multiples.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une nouvelle méthodologie pour effectuer des expériences de compétition bactérienne avec de grands pools d’inocula mélangés suivis d’une quantification précise à l’aide d’une technique de PCR numérique très sensible. Le protocole consiste à étiqueter génétiquement les souches bactériennes avec un code-barres unique d’ADN inséré sur une région inoffensive du chromosome. Cette modification permet aux souches d’être rapidement et avec précision quantifiées à l’aide de la technologie moléculaire moderne au lieu des dilutions en série traditionnelles, du placage de réplique et du comptage des unités de formation de colonies qui reposent sur des marqueurs phénotypiques (c.-à-d. résistance aux antibiotiques ). Les modifications permettent d’évaluer simultanément de nombreuses souches dans un seul inoculum mis en commun, réduisant considérablement la possibilité de variabilité expérimentale parce que toutes les souches sont exposées aux mêmes conditions exactes. En outre, bien que cette technique ait été développée dans Salmonella enterica serovar Typhimurium, elle est très adaptable à tout organisme génétiquement malléable et presque à toute conception expérimentale où des numérations bactériennes précises sont nécessaires, fournissant une nouvelle d’augmenter la précision et le débit dans les laboratoires de microbiologie sans les contraintes imposées par les méthodes précédentes.