Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen
Summary
Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır – mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.
Abstract
ATP üretimi oksidatif fosforilasyon tarafından mitokondri birincil işlevidir. Mitokondri daha yüksek ökaryotlarda da tampon sitozolik Ca2 + içinde katılmak ve mitokondriyal ATP üretiminde intramitochondrial ücretsiz Ca2 + konsantrasyon tarafından aracılık. CA2 + saklama kapasitesi mitokondri kalsiyum mitokondrial matris korumak yeteneği olarak kabul edilebilir. Birikmiş intrasellüler Ca2 + yol açan iç mitokondrial membran geçirgenliği molekülleri ile bir moleküler kaçağı neden daha az 1,5 kDa ağırlık mitokondrial geçirgenliği geçiş gözenek (mPTP), açılış olarak adlandırdığı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Burada, biz Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için iki deneyleri tarif-izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi. Ca2 + eklenir belirli miktarda sonra tüm adımları bir günde tamamladı ve Mikroplaka okuyucu tarafından kaydedildi. Böylece, bu iki basit ve etkili deneyleri Ca2 +değerlendirmek için kabul edilebilir-mitokondrial işlevleri ile ilgili.
Introduction
Mitokondri memeli hücrelerinde oksidatif fosforilasyon tarafından kullanılan ATP yaklaşık % 95’i üretmek için ana hücresel organlar vardır. Bu münzevi micromolar konsantrasyonu Ca2 + mitokondri tarafından ADP ve inorganik fosfat varlığı ADP sentez ATP1‘ e fazdan için kullanılabilir bildirilmektedir. Konsantrasyonu sitozolik Ca2 + bir eşiğin gittiğinde, mitokondri alımını Ca2 + hızla olabilir ve sızma bu yavaş yavaş. Böylece, işleyen mitokondri akını artan sitozolik Ca2 +olabilir. Oksidatif fosforilasyon katılımı için alakasız, mitokondrial Ca2 + Ayrıca sitozolik kalsiyum sinyaller de katılmak ve mitokondriyal iç mPTP açılış inducing tarafından mitokondrial apoptotik mekanizması harekete geçirmek membran2. Bu çok anormal yükselmesine intrasellüler Ca2 + 3mPTP açarak mitokondrial büyük şişlik neden olabilir kabul edilmiştir. Böylece, mitokondriyal işlev mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +miktarının tarafından değerlendirmek için bu protokolü amaçlamaktadır-mitokondrial şişlik trigged.
CA2 + saklama kapasitesi alımı sitozolik kalsiyum mitokondri yeteneği ölçümdür. Mitokondri sitozolik bedava kalsiyumu tampon ve kalsiyum-bağımlı hücresel süreçler tarafından etkin olmayan precipitates şeklinde kalsiyum alımını düzenleyen. Engelli Ca2 + saklama kapasitesi enerji sınırlama ve hatta nörodejeneratif hastalıklar4,5ile ilgili stres olayları oluşur. İzole mitokondri veya hücreleri digitonin permeabilized Ca2 + saklama kapasitesi tanımlamak için kullanılabilir ve Ca2 + ek Glutamat ve malat ile izole mitokondri tarafından birikir yeteneği yükseltilmiş tarafından etkilenen değil Mitokondrial yalıtım yordamı6. Digitonin titrated bir miktar farklı hücre tipleri plazma zarı permeabilize için kullanılmalıdır. Ca2 +hexapotassium tuz-yeşil flüoresan boya, bir Ca2 +bağlama-hassas cep impermeant görünür ışık telaşlı göstergesi, yaygın olarak kullanılan7oldu. CA2 +-floresan boya düşük-benzeşme göstergesidir ve hücre içi ücretsiz Ca2 + konsantrasyonları sırasında yükselmeye devam göstermek için kullanılan yeşil bağlama uzun süreli (5 dk) elektrodlar8. Bu yöntem radyoaktif filtre tekniği daha az hassas ancak büyük ölçüde basitleştirilmiştir. Ek Ca2 + kalsiyum yeşil Floresans yükseltir ve Ca2 + alımı mitokondri tarafından Floresans taban çizgisine döndürür. Mitokondri alımı extramitochondrial Ca2 + 9başarısız kadar Ca2 + sıralı eklemeler yapıldı. Bir floresan Mikroplaka okuyucu sürekli kalsiyum yeşil Floresans bildirmek için kullanılabilir.
Mitokondri depolarized Ca2 + birikimi sonra yayımlanan Ca2 + orta ve şişmeye başladı. CA2 +-şişme mPTP açılış belirtmek için kullanılır mitokondri tetikledi. Elektron mikroskobu ve Ca2 +ölçmek için kullanılan 540 nm can ışık Absorbans azalma-mitokondrial şişme10,11tetikledi. Mitokondri birim doğrudan nerede Absorbans düşüşler mitokondrial matris pasif şişmesi yansıtmak ileriye doğru açı ışık saçılma12‘ belirlenebilir.
Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için metodoloji göstermek-SH-SY5Y hücreleri izole mitokondri mitokondrial şişme tetikledi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +için basit ve etkili iletişim kuralı açıklanan-mitokondrial şişme tahlil tetikledi.
Mitokondrial yalıtım için tüm malzeme ve tüpler buza, özellikle hücreleri homojenizasyon zaman olduğundan emin olun. % 0.25 tripsin-EDTA yemek 37 ° C’de 5 min için hücrelerden ayırmak için de kullanılabilir. 15-25 vuruş sonra mikroskop altında sağlam hücre zarı gözlemlemek ve mitokondri zar kırılma ö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada Shandong seçkin bilim adamı (JQ201421) ve NSFC (81371226) hibe verilmesi gelen hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| SH-SY5Y cell line | ATCC (The Global Bioresource Center) | ATCC Number: CRL-2266 | |
| Calcium green-5N | Life Technologies | c-3737 | Ca2+-binding green fluorescent dye |
| complete protease inhibitors | Roche Molecular Biochemicals | 4693116001 | |
| glass homogenizer | Kimble Chase | 9885303002 | |
| glutamate | Sigma-Aldrich | RES5063G-A7 | |
| malate | Sigma-Aldrich | 46940-U | |
| rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 00457 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | V900050 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | V900266 | |
| Varioskan flash instruments | Thermo Scientific | IC100E | |
| Bongkrekate | Biovision | 1820-100 | |
| atractyloside | Sigma-Aldrich | C4992 | |
| high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium | Hyclone | SH30022 | 4.5 g/L glucose, L-glutamine, without sodium pyruvate |
| fetal bovine serum | Hyclone | SV30087 | |
| penicillin | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| streptomycin | Invitrogen | 11860-038 | |
| BCA assay kit | Thermo Scientific | NCI3225CH | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| 10 cm cell culture dish | NEST | 704001 |
References
- Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
- Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
- Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
- Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
- Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
- Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
- Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
- Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
- Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
- Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
- Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
- Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
- Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
- Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
- Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
- Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).
