Mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit Assay en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling Assay geactiveerd

Mitochondriën zijn de belangrijkste cellulaire organen te produceren bijna 95% van de ATP in de cellen van zoogdieren gebruikt door oxidatieve fosforylering. Het is gemeld dat de afgezonderd micromolar concentratie van Ca^{2 +} door de mitochondriën, de aanwezigheid van ADP en anorganisch fosfaat kan worden gebruikt om phosphorylate ADP op¹ATP synthese. Wanneer de concentratie van cytosolische Ca^{2 +} boven een drempel gaat, mitochondriën kunnen opname Ca^{2 +} snel en efflux het langzaam. Zo kunnen de functionerende mitochondriën toestroom de verhoogde cytosolische Ca^{2 +}. Irrelevant voor de deelname aan de oxidatieve fosforylatie, de mitochondriale Ca^{2 +} ook deelnemen aan de cytosolische calcium-signalen en het mechanisme van de mitochondriale apoptotic activeren door de opening van de mPTP in de binnenste mitochondriale inducerende membraan². Het is algemeen erkend dat een abnormale verhoging van de intracellulaire Ca^{2 +} mitochondriale enorme zwelling veroorzaken kan door het openen van de mPTP-³. Dus, dit protocol heeft tot doel te beoordelen van de mitochondriale functie door het kwantificeren van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-trigged mitochondriale zwelling.

CA^{2 +} retentie capaciteit is de meting van het vermogen van de mitochondriën om opname cytosolische calcium. Mitochondriën kunnen buffer het cytosolische vrij calcium en calcium-afhankelijke cellulaire processen regelen door opname van de calcium in de vorm van inactieve precipitaten. Verminderde Ca^{2 +} retentie capaciteit treedt op in stress verschijnselen die is gekoppeld aan de beperking van de energie en zelfs neurodegeneratieve ziekten^4,5. Geïsoleerde mitochondriën of digitonin-permeabel cellen kunnen worden gebruikt voor identificatie van de Ca^{2 +} retentie capaciteit, en de verhoogde capaciteit om te accumuleren Ca^{2 +} door geïsoleerde mitochondriën met de additonal glutamaat en malate wordt niet verricht door de mitochondriale isolatie procedure⁶. Een bepaalde hoeveelheid digitonin moet worden gebruikt om de permeabilize van de plasma-membranen van verschillende celtypes. Het hexapotassium zout van Ca^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof, een Ca^{2 +}-gevoelige cel-impermeant zichtbaar licht-prikkelbaar indicator, gebruikte⁷is geweest. CA^{2 +}-bindende groen fluorescente kleurstof is een indicator van de lage-affiniteit en gebruikt om te tonen dat intracellulaire gratis Ca^{2 +} concentraties stijgen blijven tijdens langdurige (5 min) stimulaties⁸. Deze methode is minder gevoelig dan de radioactieve filter techniek maar werd sterk vereenvoudigd. De extra Ca^{2 +} calcium groene fluorescentie verheft en de Ca^{2 +} ICT door mitochondriën retourneert de fluorescentie op basislijn. Opeenvolgende toevoegingen van Ca^{2 +} aangebracht totdat de mitochondriën niet opname extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Een fluorescentie microplate lezer kan worden gebruikt om voortdurend verslag de calcium groene fluorescentie.

Na Ca^{2 +} accumulatie, mitochondriën depolarized, vrijgegeven Ca^{2 +} in het medium, en begon te zwellen. CA^{2 +}-mitochondriën zwelling wordt gebruikt om aan te geven van de opening van de mPTP geactiveerd. Elektronenmicroscopie en de daling lichtabsorptie bij 540 nm kan worden gebruikt voor het meten van de Ca^{2 +}-geactiveerd mitochondriale zwelling^10,11. Volume van de mitochondriën kan rechtstreeks worden bepaald door de voorwaartse hoek lichtverstrooiing¹², waar de dalingen van de extinctie passieve zwelling van de mitochondriale matrix reflecteren.

Hier, we illustreren de methodologie te onderzoeken van de mitochondriale Ca^{2 +} retentie capaciteit en Ca^{2 +}-mitochondriale zwelling in geïsoleerde mitochondriën van de cellen van de SH-SY5Y geactiveerd.