Mitocondrial de Ca^{2 +} retención capacidad análisis y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca^{2 +} por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP¹. Cuando la concentración citosólica Ca^{2 +} por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca^{2 +} rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca^{2 +}. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca^{2 +} también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana². Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular^{2 +} puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP³. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-trigged hinchazón mitocondrial.

Capacidad de retención de CA^{2 +} es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca^{2 +} retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades^4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca^{2 +} , y la elevada capacidad para acumular Ca^{2 +} por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento⁶. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca^{2 +}-enlace colorante fluorescente verde, un Ca^{2 +}-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado⁷. CA^{2 +}-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca^{2 +} las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos⁸. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca^{2 +} eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca^{2 +} por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca^{2 +} hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.

Después de la acumulación de Ca^{2 +} , mitocondrias despolarizado, liberan Ca^{2 +} en el medio y comenzaron a hincharse. CA^{2 +}-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca^{2 +}-activa de^10,hinchazón mitocondrial¹¹. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera¹², donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.

Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca^{2 +} capacidad de la retención y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.