Митохондриальной Ca^{2 +} сохранение потенциала пробирного и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек Assay

Митохондрии являются основной сотовой органов производить почти 95% АТФ, используемые окислительного фосфорилирования в mammalian клетках. Сообщается, что поглощенных всех концентрации Ca^{2 +} , митохондрии, присутствие ADP и неорганического фосфата может использоваться для фосфорилировать ADP синтеза АТФ¹. Когда концентрация цитозольной Ca^{2 +} идет выше порога, митохондрии можно поглощение Ca^{2 +} быстро и измеряем его медленно. Таким образом функционирования митохондрий может приток увеличение цитозольной Ca^{2 +}. Отношения к участию в окислительного фосфорилирования, митохондриальных Ca^{2 +} также принимают участие в цитозольной кальция сигналов и активировать механизм митохондриальной apoptotic, вызывая открытие mPTP в внутренней митохондриальной ²мембраны. Широко признано, что аномальные повышение внутриклеточной Ca^{2 +} может вызвать митохондриальной массивные отеки, открыв mPTP³. Таким образом, этот протокол призван оценить функцию митохондрий путем определения количественных показателей митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-trigged митохондриальной отек.

CA^{2 +} водоудерживающего потенциала является измерение способности митохондрий цитозольной поглощение кальция. Митохондрий может регулировать кальций зависимых клеточных процессов поглощения кальция в виде неактивных преципитаты и буфере цитозольной свободного кальция. Нарушением Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала происходит в стресс явления, связанные с ограничением энергии и даже нейродегенеративных заболеваний^4,5. Изолированных митохондриях или digitonin-permeabilized клетки могут использоваться для идентификации Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала, и повышенной способностью накапливать Ca^{2 +} , изолированных митохондриях с дополнительная глутамата и малат не осуществляется митохондриальной изоляции процедура⁶. Титруемая количество digitonin должен быть использован для разрушения мембран плазмы из различных типов клеток. Hexapotassium соль Ca^{2 +}-привязка зеленого флуоресцентного красителя, Ca^{2 +}-чувствительных клеток impermeant видимый свет возбудимых индикатор, был широко используется⁷. CA^{2 +}-привязки зеленого флуоресцентного красителя является показателем низкого сродства и используется, чтобы показать, что внутриклеточные бесплатно Ca^{2 +} концентрации продолжать расти в течение длительного (5 мин) стимуляцию⁸. Этот метод был менее чувствительны, чем метод радиоактивных фильтр, но была значительно упрощена. Дополнительные Ca^{2 +} возвышает кальция Зеленая Флуоресценция и Ca^{2 +} поглощение митохондрий возвращает флюоресценция базовой линии. Последовательных добавлений Ca^{2 +} были сделаны до тех пор, пока митохондрии не поглощения extramitochondrial Ca^{2 + 9}. Считыватель микропланшетов флюоресценции может использоваться непрерывно доклад кальция зеленой флуоресценцией.

После Ca^{2 +} накопления митохондрии деполяризованный, выпущенный Ca^{2 +} в среду и начал набухать. CA^{2 +}-срабатывает митохондрий, отек используется для обозначения mPTP открытия. Электронная микроскопия и уменьшение поглощения света на 540 Нм может использоваться для измерения Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной отек^10,11. Митохондрии тома можно непосредственно определяется Форвард угол рассеяния света¹², где уменьшение поглощения отражают пассивной отек митохондриальной матрицы.

Здесь, мы иллюстрируем методологии для изучения митохондриальной Ca^{2 +} водоудерживающего потенциала и Ca^{2 +}-срабатывает митохондриальной припухлость в изолированных митохондриях от SH-SY5Y клеток.