ミトコンドリアの Ca^{2 +}保持容量測定と Ca^{2 +}-ミトコンドリアの膨潤アッセイをトリガー

ミトコンドリアは、酸化的リン酸化による哺乳類細胞で使用される ATP の約 95% を生産する主要な細胞器官です。合成 ATP¹に ADP をリン酸化して使用できます、ADP と無機リン酸の存在、人里離れたマイクロモル濃度 Ca^{2 +}ミトコンドリアによって報告されます。細胞内 Ca^{2 +}濃度がしきい値を超えると、ミトコンドリアが取り込み Ca^{2 +}急速および流出それゆっくり。したがって、機能しているミトコンドリアは、増加した細胞内 Ca^{2 +}の流入をことができます。無関係酸化的リン酸化に関与する、ミトコンドリア Ca^{2 +}もゾル性細胞質カルシウム信号の部分を取るし、mPTP のミトコンドリアの内側の開口部を誘導することによってミトコンドリアを介したアポトーシスのメカニズムをアクティブにします。膜²。細胞内 Ca^{2 +}の異常上昇が mPTP³を開くことによってミトコンドリアの大規模な腫れを引き起こすことができる広く認識されています。したがって、このプロトコルがミトコンドリアの Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を定量化することでミトコンドリアの機能を評価することを目的-ミトコンドリアの膨潤が起きるというものです。

Ca^{2 +}保持能力ゾル性細胞質カルシウムを摂取するミトコンドリアの機能の測定であります。ミトコンドリアは細胞内遊離カルシウムをバッファーし、使用頻度の低い沈殿物の形でカルシウム摂取によってカルシウム依存性細胞プロセスを調整できます。障害者 Ca^{2 +}保持能力にエネルギー制限とも神経変性疾患^4,5に関連するストレス現象に発生します。ミトコンまたはジギトニン グリセリン細胞 Ca^{2 +}保持能力を識別するために使用できます、追加グルタミン酸とリンゴ酸分離ミトコンドリアによる Ca^{2 +}を蓄積する高い能力は受けない、ミトコンドリアの分離手順⁶。ジギトニンの滴定された量を使用して、異なる種類の細胞の細胞膜を permeabilize ください。Hexapotassium 塩 Ca^{2 +}-緑色蛍光染料、Ca^{2 +}の結合-敏感な細胞非透過性可視光興奮インジケーターは、広く使用されている⁷をされています。Ca^{2 +}-(5 分) 刺激⁸延長バインド緑蛍光染料は低親和性インジケーターで、無料の細胞内 Ca^{2 +}濃度が上昇し続けることを示すために使用します。このメソッドは、放射性フィルター技術よりも敏感だったが、大幅に簡略化します。追加 Ca^{2 +}カルシウム緑色蛍光を高め、ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収がベースラインに蛍光を返します。逐次追加の Ca^{2 +}は、ミトコンドリア吸収 extramitochondrial Ca^{2 + 9}に失敗するまで行われました。蛍光マイクロ プレート リーダーは、継続的にカルシウム緑色蛍光を報告する使用できます。

Ca^{2 +}蓄積の後、ミトコンドリアが脱分極し、中に Ca^{2 +}放出ははれだした。Ca^{2 +}-腫れ、mPTP 開口部を示すためミトコンドリアをトリガーします。電子顕微鏡、Ca^{2 +}の測定に使用に 540 nm の吸光度の減少-ミトコンドリアの膨潤^10,11をトリガーします。前方角度光散乱で¹²、吸光度の減少がミトコンドリアのマトリックスの受動的な腫れを反映ミトコンドリア ボリュームを直接的に確認することができます。

ここで、我々 はミトコンドリアの Ca^{2 +}保持能力と Ca^{2 +}を検討する方法論を説明-SH SY5Y 細胞から分離ミトコンドリア ミトコンドリアの膨潤をトリガーします。