Mitocondriale di Ca^{2 +} ritenzione capacità Assay e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale Assay

I mitocondri sono i principali organi cellulari per produrre quasi il 95% del trifosfato di adenosina usato nelle cellule dei mammiferi di fosforilazione ossidativa. È stato riferito che la concentrazione micromolar sequestrata di Ca^{2 +} dai mitocondri, la presenza di ADP e fosfato inorganico può essere utilizzato per fosforilare ADP a sintesi ATP¹. Quando la concentrazione di Ca citosolico^{2 +} supera una soglia, i mitocondri possono l’assorbimento di Ca^{2 +} rapidamente e di efflusso e lentamente. Così, i mitocondri di funzionamento possono afflusso l’aumento citosolico Ca^{2 +}. Irrilevante per la partecipazione nella fosforilazione ossidativa, il mitocondriale Ca^{2 +} anche partecipare i segnali di calcio citosolico e attivare il meccanismo apoptotico mitocondriale inducendo l’apertura della mPTP nella parte interna mitocondriale membrana². È stato ampiamente riconosciuto che l’elevazione anormale del intracellulare di Ca^{2 +} può indurre mitocondriale gonfiamento voluminoso aprendo il mPTP³. Così, questo protocollo ha lo scopo di valutare la funzione mitocondriale di quantificare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale.

Capacità di ritenzione di CA^{2 +} è la misura della capacità dei mitocondri di calcio citosolico di assorbimento. I mitocondri possono buffer il calcio libero citosolico e regolano i processi cellulari di calcio-dipendente dall’assorbimento di calcio sotto forma di precipitati inattivi. Capacità di ritenzione alterata Ca^{2 +} si verifica nei fenomeni di stress associati a limitazione di energia e anche neurodegenerative malattie^4,5. Mitocondri isolati o cellule della digitonina-permeabilized possono essere utilizzate per identificare la capacità di ritenzione di Ca^{2 +} , e l’elevata capacità di accumulare Ca^{2 +} di mitocondri isolati con il glutammato additonal e malate non avviene mediante il isolamento mitocondriale procedura⁶. Una quantità di Estratto titolata di digitonina deve essere utilizzata per permeabilize le membrane del plasma di diversi tipi di cellule. Il sale di hexapotassium di Ca^{2 +}-associazione tintura fluorescente verde, Ca^{2 +}-indicatore luce-eccitabile visibile cellula-impermeant sensibile, è stato ampiamente usato⁷. CA^{2 +}-associazione verde colorante fluorescente è un indicatore di bassa affinità e utilizzati per dimostrare che intracellulare Ca^{2 +} le concentrazioni libere di continuare ad aumentare durante prolungato di stimolazioni (5 min)⁸. Questo metodo era meno sensibile che la tecnica di filtro radioattivo, ma è stato notevolmente semplificato. Ulteriori Ca^{2 +} eleva fluorescenza verde di calcio e l’assorbimento di Ca^{2 +} dai mitocondri ritorna la fluorescenza ai valori basali. Fino a quando i mitocondri non è riuscito a assorbimento extramitochondrial Ca^{2 + 9}, sono state fatte aggiunte sequenziale di Ca^{2 +} . Un lettore di micropiastre di fluorescenza può essere utilizzato per segnalare continuamente la fluorescenza verde di calcio.

Dopo Ca^{2 +} accumulo, mitocondri depolarizzarono, scaricata Ca^{2 +} nel terreno e ha cominciato a gonfiarsi. CA^{2 +}-innescato mitocondri gonfiore viene utilizzato per indicare l’apertura di mPTP. La microscopia elettronica e la diminuzione di luce assorbanza a 540 nm può essere usato per misurare il Ca^{2 +}-innescato mitocondriale gonfiore^10,11. Volume di mitocondri può essere determinata direttamente da angolo in avanti dispersione della luce¹², dove diminuisce di assorbanza riflettono passiva gonfiore della matrice mitocondriale.

Qui, vi illustriamo la metodologia per esaminare la capacità di ritenzione mitocondriale Ca^{2 +} e Ca^{2 +}-innescato gonfiamento mitocondriale in mitocondri isolati da cellule SH-SY5Y.